乳酸菌是公认的益生菌,它广泛地分布在自然界和我们的生过环境当中并且被应用于食品加工、医疗保健等相关领域。作为人体的正常菌群,乳酸菌对人们的健康起着极为重要的作用,尤其是近年来,不断有研究显示它有助于控制体重,可以保护心血管系统,调节免疫反应,抑制肿瘤等。随着现代社会的快速发展,医疗科学技术也在不断提高,人们对健康的关注点从以往的感染性疾病、心血管疾病等常见慢性病扩大到了口腔卫生保健领域。然而龋齿、牙周病等口腔疾病发病率居高不下,传统的治疗方式作用有限。近年来益生菌疗法对肠道疾病的防治取得了显著的成效,而在口腔中的应用尚不多见。本课题的主要研究目的就是分离筛选优质口腔乳酸杆菌,对其益生效果进行评价,阐明其益生功能,并进行初步的人群实验,制成易于储运的片剂,以改善官兵的口腔环境,提高部队的战斗能力。我们从健康志愿者口腔中采集唾液样本,并从中分离出一系列的乳酸杆菌。通过对他们抑制病原菌能力,抗生素耐药性,生物膜形成能力、产H₂O₂和产酸能力的测定,筛选出一株潜在的优质乳酸菌。通过对其16s rDNA进行测序和生化鉴定,得知这是一株唾液乳酸杆菌,我们将其在中国普通微生物保藏中心进行保藏并取得了编号CGMCC 12857。为了解12857的基因组信息,我们对其进行了全基因组测序并将注释结果在多个数据库中进行比对和分析,除了基因组的基本信息外,我们还比对了多种与代谢通路、转运蛋白相关的基因,从而在核酸水平上探究12857的益生功能,解释其益生机理。作为一种最终要运用于人体、有可能引起毒性作用的活性菌株,我们需要对其进行毒理学评价。本部分内容按照我国食品药品监督管理局颁发的《药物单次给药毒性研究技术指导原则》和《药物重复给药毒性研究试验技术指导原则》,采用SD大鼠进行急性毒性试验和重复给药毒性试验,分别观察12857是否会造成实验动物的急性死亡或对动物造成慢性影响。通过对实验动物的一般行为特征,体重、脏器指数、血液学指标和生化学指标进行观察和测定,我们未发现试验组和对照组动物存在显著且合理的差异,最终我们认为,12857对动物无急性或慢性毒性,可以作为无毒无害的安全性食用品。在进行12857体外益生功能评价时,我们用体外易于培养的Hela细胞系,对口腔正常细胞进行模拟,以评价12857在细胞水平上的免疫调节功能。益生菌在口腔环境中易于定殖和生存是其发挥所有功能的前提,我们通过对12857黏附细胞能力的测定来评价其是否易于定殖于口腔中;同时我们分别通过检测细胞代谢过程中的LDH和MTT,测定12857对细胞的毒性和对细胞的生长促进作用;另外我们通过western blot的方法对细胞自噬和凋亡的有关蛋白进行检测,以评价12857是否会影响细胞正常的自噬和凋亡;LPS是常见的细胞致炎性因子,为了探究12857对细胞炎性反应的调控,我们分别在细胞高炎性状态和正常状态下观察它是否会引起几种常见的细胞炎性因子TNF-α、IL-1β、IFN-β表达量的改变。结果显示,相比于对照菌株,12857黏附能力强,非常容易定殖于口腔环境,同时他不会引起细胞膜的破坏造成细胞的凋亡和坏死,对细胞活性抑制作用较小,有利于细胞的生长繁殖;通过WB未发现12857会引起细胞发生异常的凋亡和坏死;另外,12857可以引起促炎性细胞因子TNF-α和IFN-β的表达量上升,同时抑制LPS引起的IL-1β表达量上升,实验结果表明12857可以调节调节细胞因子的释放,调控细胞炎性反应。为了将12857制备成易于储运的片剂并最终用于改善官兵的口腔健康,首先需要对其进行扩大生产和加工。我们在军事科学院生物工程研究所中试生产基地进行了对12857的大规模生物发酵、离心收集和冻干,将其制备成菌粉,并将菌粉交于鑫福瑞康生物医药科技有限公司进行压片和包装形成商品化的12857乳酸菌含片。我们将乳酸菌含片分发给招募的军人志愿者,进行为期一个月的人群实验,然后分别采取受试者实验前、后的牙菌斑和唾液样本,提取样本总核酸后进行16s二代高通量测序,通过OTU聚类分析、稀疏性曲线、Beta多样性分析和多样品物种分类探究受试者的口腔微生物组成和改变。实验结果揭示了样本所代表的我国北方地区军人的口腔菌群主要由厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门组成;受乳酸菌12857干预后,唾液样本组成变化相对较大,证明其较容易受外界环境干扰;Metastats分析结果显示,在干预后乳酸菌含量显著上升,同时一系列的口腔致病菌如放线菌、卟啉单胞菌、普雷沃特菌、链球菌等的含量显著下降;实验结果还证明,除了在体外模拟环境中,乳酸菌12857亦能在体内环境中抑制有害菌的生长,保护口腔健康的环境。同时,我们建立了一种快速、灵敏、方便的LAPM检测技术,用来从临床样本中检测常见的牙周病致病菌具核梭杆菌。这种技术可以检测到“种”的水平,用来对16s二代高通量测序结果进行补充;同时与传统的PCR技术相比,LAMP反应耗时短,对仪器设备要求简单,敏感性高,特异性良好。对临床样本检测结果显示,其检出率高于传统PCR的方法。综上所述,本课题分离出一株优质的乳酸杆菌,它具有口腔保健的功能,并且安全可靠,可以在部队官兵执行特殊任务或卫生条件受限的情况下,用来保护他们的口腔环境,维持口腔健康,也为以乳酸菌为主要成分的保健用品在口腔中的开发和应用奠定理论基础。