棉纤维是重要的纺织工业原料,在国民经济和人民生活中占有重要的位置。棉纤维实质上是胚珠外珠被上的表皮细胞分化发育而成的一种单细胞结构,是研究细胞极性生长的模式材料。因此,从分子水平阐明棉纤维发育的机理,具有重要的理论价值与现实意义。本研究的目的即利用基因芯片技术、文库扫描和植物遗传转化方法,分离和鉴定纤维发育相关基因,进一步阐明纤维细胞极性生长发育的分子机理。主要内容包括以下三点：一、棉纤维发育早期优势表达ESTs分析利用本实验室构建的高强纤维种质系7235开花后5-25天棉纤维伸长、次生壁加厚期间的cDNA文库,随机大规模测序,获得1436条非冗余的ESTs,制成基因芯片。提取陆地棉徐州142野生型和徐州142无绒无絮突变体纤维发育前期2DPA、4DPA、6 DPA的mRNA与之杂交,筛选到152条上调表达ESTs,分为7类：41条ESTs在2DPA、4DPA、6DPA均上调表达,4条ESTs在2DPA、4DPA均上调表达,14条ESTs在4DPA、6DPA均上调表达,12条ESTs在2DPA、 6DPA均上调表达,仅在2DPA、4DPA或6DPA上调表达的ESTs数分别为12、15、54；筛选到65条下调表达ESTs,1条EST在2DPA、4DPA、6DPA均下调表达,10条ESTs在4DPA、6DPA均下调表达,1条EST在2DPA、6DPA均下调表达,仅在2DPA、4DPA或6DPA下调表达的ESTs数分别为1、14、38。对差异表达ESTs进行功能分类,结果包括能量和碳水化合物代谢,细胞结构和组织、蛋白质代谢、运输、脂代谢、细胞骨架、转录、环境反应和防卫、核酸代谢、信号、激素、次级代谢类,其中属于能量和碳水化合物代谢类的ESTs最多。对217条差异表达ESTs进行引物设计,一共设计了73对引物,通过RT-PCR验证,34对引物获得扩增结果,其中24条ESTs与基因芯片结果一致,阳性率为70.6%。利用RT-PCR引物作为标记进行染色体定位研究,共有来源于19条ESTs设计的RT-PCR引物在作图群体中产生多态位点,最终将26个多态位点定位在染色体上。此研究为纤维发育前期相关基因的分离和鉴定打下了基础。二、棉纤维膜联蛋白基因GhFAnn1和GhFAnnx的克隆和鉴定从棉花优质材料7235不同棉纤维发育混合cDNA文库中分离出两个克隆,均编码纤维膜联蛋白基因,分别命名为GhFAnn1和GhFAnnx。 GhFAnn1克隆插入片段长度为1200bp,通过两次TAIL-PCR技术分别得到5’上游724bp和747bp两个片段,与原序列拼接后,得到一1800bp的全长GhFAnn1序列。其开放读码框长度为951bp,编码316个氨基酸,编码产物理论分子量约为36.0kDa,理论等电点为6.34,ORF上游具有同框终止子。Blast结果表明,与棉花中已报道的一个annexin基因FAnn cDNA序列的ORF区在核苷酸水平上一致性达到98%。从表达特征上来看,GhFAnn1基因属组成性表达基因,在根、茎、叶及纤维发育不同时期均有表达,且在17DPA的时候略有降低。Southern杂交结果表明GhFAnn1基因在陆地棉基因组中存在两个拷贝,其中A、D亚组中各有一个拷贝。在四倍体陆地棉TM-1和海岛棉Hai7124、二倍体非洲棉和雷蒙德氏棉中分离得到GhFAnn1重复基因的基因组序列,结果表明,GhFAnn1来自于四倍体棉A亚基因组,而另外一个亚组的GhFAnn1基因与棉花中已报道的annexin基因FAnn cDNA序列的ORF区在核苷酸水平上完全相同。因此,本研究克隆的GhFAnn1和已报道的FAnn属于部分同源基因。染色体定位分析将GhFAnn1定位于D5染色体。GhFAnnx克隆插入片段长度为1157bp,其开放读码框长度为945bp,编码314个氨基酸,编码产物理论分子量约为35.7kDa,理论等电点为6.49,ORF上游具有同框终止子。Blast结果表明,与草莓中已报道的annexin基因同源性最高,是棉纤维膜联蛋白家族的一个新成员。从表达特征上来看,RT-PCR分析显示GhFAnnx属纤维细胞优势表达基因,在根、茎、叶中表达量极低,在纤维发育不同时期表达量均很高,仅在17DPA的时候略有降低。进一步的Northern杂交结果证明GhFAnnx属纤维优势表达基因,在根、茎、叶中表达量较低,在5 DPA、8 DPA、11 DPA、14 DPA表达量较高,到17DPA骤降。在四倍体陆地棉TM-1、海岛棉Hai7124、二倍体非洲棉和雷蒙德氏棉中均分离得到GhFAnnx基因相应的基因组序列,本研究获得的GhFAnnx基因来自四倍体棉A亚基因组,染色体定位分析将其定位于A10染色体。三、棉纤维膜联蛋白基因的转基因功能初步分析为了阐明GhFAnn1和GhFAnnx两个基因的功能,分别构建了这两个基因一系列不同植物表达载体,通过不同的遗传转化方法,研究这两个基因在植物细胞中的功能。首先,分别构建了GhFAnn1和GhFAnnx两个基因与绿色荧光蛋白(GFP)融合的瞬时表达载体,通过基因枪分别转化洋葱表皮细胞和棉花开花当天的胚珠,研究这两个基因在植物细胞中的亚细胞定位情况。基因枪转化洋葱表皮细胞后,结果发现,这两个基因的定位情况相同,绿色荧光在细胞中均是普遍存在的,即细胞膜、细胞质和细胞核中都有绿色荧光,而且通过20%蔗糖处理后证明,两个基因的编码产物都是定位在细胞膜上不是在细胞壁上。另外,基因枪转化棉花当天的胚珠表皮细胞,通过纤维的离体培养,在纤维发育14DPA的时候,将纤维剥离胚珠,观察绿色荧光,结果发现,这两个基因的定位情况也相同,绿色荧光均聚集于纤维细胞顶端的边缘和内部区域,而且呈点状分布。其次,我们分别构建了GhFAnn1和GhFAnnx两个基因一共6个植物表达载体,分别为GhFAnn1基因与GUS报告基因融合的正义载体(SAnn1)、 GhFAnn1基因全长片段的反义载体(GhFAnn1)、GhFAnn1基因3’特异片段的反义载体(3ASAnn1), GhFAnnx基因与GUS报告基因融合的正义载体(SAnn2)、 GhFAnnx基因全长片段的反义载体(ASAnn2)、GhFAnnx基因保守区片段的干扰载体(IAnn2).利用农杆菌介导的遗传转化方法分别将此6个载体导入棉花WO品系,通过棉花体细胞胚胎发生途径获得转基因植株。对每个再生单株都进行NPTII和启动子-基因特异的PCR检测,以及对GhFAnnl和GhFAnnx正义载体,分别通过GUS染色分析转化是否成功和这两个基因在棉花组织器官的表达定位特征。结果表明,6个不同载体均获得了转基因株系。另外,GUS染色检测表明,通过农杆菌转化棉花下胚轴体细胞胚胎再生获得的胚性愈伤,报告基因GUS是嵌合的；而且通过对转GhFAnnl和GhFAnnx正义载体阳性小苗不定根的GUS染色分析发现,annexins基因聚集于根尖部位,即高分泌区部位。GhFAnnl和GhFAnnx两个基因的不同类型载体棉花遗传转化株系的获得,为进一步研究annexins基因在棉花纤维细胞极性发育和生理反应过程中发挥的功能奠定了基础。