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背景：肺纤维化(pulmonary fibrosis)是一种原因不明的弥漫性肺疾病,主要表现为弥漫性肺泡炎、肺泡单位结构紊乱和细胞外基质沉积,最终导致肺脏结构和功能的严重破坏。流行病学调查发现,肺纤维化的发病率、死亡率不断上升,而且随着年龄的增长,其发病率和死亡率也逐渐升高。目前其发病机制尚未完全阐明。近年来的研究表明肺成纤维细胞在肺纤维化的发生、发展中起重要作用,它不仅是重要的间质细胞,也是活跃的分泌细胞,并表现出免疫炎症细胞的特性。它可合成胶原蛋白、弹性蛋白、基质金属蛋白酶和组织型金属蛋白酶抑制物,并且通过调节细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的代谢,参与组织重建。研究显示,肺成纤维细胞的迁移在肺纤维化中起关键作用,在各种损伤因素的刺激下,肺成纤维细胞被激活,经过上皮细胞基膜的间隙迁移至肺泡损伤处,并在该处沉积及增殖,分泌大量细胞外基质,启动损伤修复过程,最终导致肺纤维化。因此,阻断肺成纤维细胞的迁移和分泌细胞外基质是延缓肺纤维化发生发展的重要机制。肾素一血管紧张素系统(RAS)目前被认为是存在于心、肾、脑和肺等组织局部的内分泌系统之一,其中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)为该系统的主要效应分子。AngⅡ由血管紧张素Ⅰ(angiotensin I, AngⅠ)在血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme, ACE)的作用下转化而来。最近的研究发现Ang Ⅱ不仅参与心肌重塑、肾纤维化等发生发展过程,而且可能通过刺激细胞增殖、趋化炎性细胞等作用,参与肺纤维化的发生发展过程。研究发现AngⅡ通过血管紧张素受体(AngⅡ type Ⅰ receptor, AT1R和AngⅡ type Ⅱ receptor, AT2R)激活肺成纤维细胞,并促进其增殖和分泌细胞外基质,使胶原蛋白等细胞外基质在肺间质大量沉积,促进肺纤维化的发生发展,但其机制尚不十分明确。此外,Konigshoff M等发现Ang Ⅱ通过AT1R受体介导原代肺成纤维细胞迁移促进肺纤维化的形成,但未进一步研究上述现象的具体机制,且国内外关于Ang Ⅱ对肺成纤维细胞迁移作用机制的报道很少。因此,研究Ang Ⅱ对肺纤维化的具体作用机制以及阻断Ang Ⅱ发挥作用的途径,可以为肺纤维化的治疗提供新的理论依据和寻求更有效的治疗手段。近年来,氧化应激反应在多种器官组织慢性炎性纤维化中的作用受到了日益广泛的关注,其是指机体内高活性氧物质(Reactive oxygen species, ROS)产生过多,超出了机体的清除能力,导致氧化/抗氧化失衡的一种状态。大量的研究发现特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)患者和肺纤维化动物模型肺组织中,氧化应激水平明显增高,血浆中抗氧化物明显减少,提示氧化／抗氧化失衡可能在肺维化发病中发挥重要的作用。同时,Ang Ⅱ也是引起氧化应激的最强刺激之一。已有的证据表明AngⅡ通过诱导血管平滑肌细胞、内皮细胞、肝星状细胞等产生ROS,参与动脉粥样硬化、心纤维化和肝纤维化等疾病的形成。因此我们推测,ROS可能参与了AngⅡ诱导的肺纤维化的形成。ROS主要由NADPH氧化酶(NOX)催化产生。NOX包括NOX1、NOX2、 NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2,其表达具有组织特异性,在肺成纤维细胞主要表达的是NOX4。研究发现在心血管系统和肝脏,Ang Ⅱ通过引起NOX4活化,促进NOX4产生ROS,进而激活细胞内信号转导系统表达相应的活性产物,参与血管平滑肌细胞和肝星状细胞的迁移。然而,在肺成纤维细胞中,Ang Ⅱ是否也能激活NOX4产生ROS,以及NOX4来源的ROS是否参与了Ang Ⅱ诱导的肺成纤维细胞迁移和细胞外基质合成,目前国内外的研究甚少。鉴于此,本研究应用NADPH氧化酶抑制齐DPI、NOX4siRNA及ROS抑制剂NAC来观察其对Ang Ⅱ诱导的大鼠肺成纤维细胞ROS产生的影响,并进一步观察其对下游效应包括下游的信号通路分子Rock2、细胞迁移及细胞外基质合成三方面的作用。血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting enzyme2, ACE2)/血管紧张素(1-7)(Angiotensin(1-7), Ang(1-7))/Mas轴是最近发现的RAS的新组分,该轴能负性调节ACE-AngⅡ-AT1R轴。ACE2通过降解Ang Ⅱ产生具有保护作用的Ang(1-7),Ang(1-7)通过与受体Mas结合拮抗Ang Ⅱ的作用。在肺疾病的研究中,Ferreira AJ等发现ACE2的激动剂可以明显降低实验性大鼠肺动脉高压,而过表达的ACE2及Ang(1-7)可以显著抑制BLM诱导的大鼠肺纤维化。虽然ACE2及Ang(1-7)在动物实验中获得满意的治疗肺纤维化的效果,但其具体分子机制还尚未明确,阻碍进一步的临床研究。而既往的研究发现,Ang(1-7)通过减少ROS的产生抑制血管平滑肌细胞迁移,那么Ang(1-7)抑制肺纤维化和肺成纤维细胞迁移的分子机制是否与抑制Ang Ⅱ对NOX4/ROS/Rock2通路的激活作用有关,我们通过体内及体外实验给予阐述。方法：体外实验：用酶消化联合组织贴壁法分离培养wistar大鼠原代肺成纤维细胞,采用第三至五代细胞进行下列实验：(1)Ang Ⅱ浓度梯度：control、AngⅡ(10-9、10-7、10-5mmol/ml);(2) control, AngⅡ, AngⅡ+DPI (NOX抑制剂)、AngⅡ+NAC (ROS抑制剂)；(3) control、AngⅡ、AngⅡ+Y27632(Rock2抑制剂)；(4)原代肺成纤维细胞转染小干扰RNA (NOX4siRNA)48h后予AnGⅡ刺激,分为control, AngⅡ、NTsiRNA、NTsiRNA+AngⅡ、NOX4siRNA、 NOX4siRNA+AngⅡ、(5) control、AngⅡ、AngⅡ+Ang(1-7)、AngⅡ+Ang(1-7)+A779(Mas受体抑制剂)、AngⅡ+Irbesartan (ATIR抑制剂)；(6) control、 Ang(1-7)、Ang(1-7)+Irbesartan、Ang(1-7)+A779。利用transwell检测细胞的迁移、Western blottting检测NOX4、α-collagen Ⅰ蛋白表达情况、荧光分光光度计检查细胞ROS的表达、RT-PCR检测Rock2mRNA变化、。体内实验：将24只体重为200-300g的雄性wistar大鼠随机分成4组,每组6只：control组(气管内滴入生理盐水200u1),BLM组(气管内滴入博来霉素(bleomycin, BLM,5mg/kg), BLM+Ang(1-7)组(气管内滴入BLM的同时皮下持续泵入Ang(1-7),25ug·kg-1·h-1), BLM+AngⅡ组(气管内滴入BLM的同时皮下持续泵入Ang Ⅱ,25ug·kg-1·h1)。上述模型于气管内滴入BLM或生理盐水4周后取右下肺组织行病理切片、HE染色观察肺组织纤维化情况,Masson染色测定组织胶原的含量,应用、Vestern blotting检测NOX4、α-collagen I蛋白的表达水平,应用免疫荧光检测组织NOX4蛋白的表达水平,利用分光光度计检测组织H202的表达量,应用RT-PCR检测ACE2、ACE、Mas、ATIR和Rock2mRNA的表达水平。统计学方法：采用SPSS13.0软件进行统计分析,资料以均数±标准差(x±s)表示。总体均数的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),各组间多重比较采用LSD法和SNK法检验,以P<0.05为有统计学意义。结果：体外实验结果1.AngⅡ促进原代肺成纤维细胞迁移和胶原合成。不同浓度的AngⅡ (10-9、10-7、10-5mmol/ml)均能促进原代肺成纤维细胞迁移和胶原蛋白(α-collagen I)的表达,在10-7mmol/ml促进作用最强。2.AngⅡ通过激活NOX4来源的ROS促进原代肺成纤维细胞迁移和胶原的合成。不同浓度的AngⅡ (10-9、10-7、10-5mmol/ml)均能促进NOX4蛋白的表达和ROS的生成,10"7mmol/ml时效果最显著。DPI (NOX抑制剂)和NAC(ROS抑制剂)显著抑制Ang Ⅱ诱导的细胞迁移和胶原蛋白表达的增加。不仅DPI和NAC能减少Ang Ⅱ (10-7mmol/ml)诱导ROS的产生,而且NOX4siRNA也能抑制Ang Ⅱ诱导的ROS的产生。3.NOX4/ROS通过下游的Rock2信号分子促进原代肺成纤维细胞迁移和胶原的合成。AngⅡ组Rock2mRNA的表达水平较control组明显升高；Y27632(Rock2抑制剂)显著抑制Ang Ⅱ诱导的细胞迁移和a-collagen I蛋白表达；进一步检测发现DPI、NAC和NOX4siRNA明显的抑制AngⅡ对Rock2mRNA的促进作用。4.Ang(1-7)阻断AngⅡ激活NOX4/ROS/Rock2信号通路。AngⅡ+Ang(1-7)组、AngⅡ+Irbesartan组NOX4蛋白表达水平较AngⅡ组明显减少,而AngⅡ+Ang(1-7)+A779组较AngⅡ+Ang(1-7)组明显升高；Ang(1-7)和Irbesartan显著抑制AngⅡ诱导的ROS的增加,A779也明显阻断Ang(1-7)对AngⅡ诱导ROS增加的抑制作用。同时,检测下游信号通路分子Rock2mRNA表达水平的变化,发现Ang(1-7)和Irbesartan具有明显的阻断Ang Ⅱ激活Rock2mRNA的作用；A779则显著抑制Ang(1-7)的上述作用。5.Ang(1-7)通过Mas受体抑制AngⅡ诱导的原代肺成纤维细胞迁移及胶原表达。AngⅡ+Ang(1-7)组和AngⅡ+Irbesartan组细胞迁移数量较Ang Ⅱ明显减少,AngⅡ+Ang(l-7)+A779组较AngⅡ+Ang(1-7)组明显增多；与AngⅡ组比,AngⅡ+Ang(1-7)组和AngⅡ+Irbesartan组a-collagen Ⅰ蛋白的表达下降,AngⅡ+Ang(1-7)+A779组的表达则增加。6.Ang(1-7)通过ATlR受体促进原代肺成纤维细胞迁移和胶原合成。与control组比,单独给予Ang(1-7)刺激细胞24h后细胞迁移的数量增加,而且a-collagen Ⅰ蛋白的表达也升高；Irbesartan能显著抑制Ang(1-7)的促迁移和促胶原合成作用,A779则增强Ang(1-7)的促迁移和促胶原合成作用。Ang(1-7)单纯刺激细胞后,细胞内NOX4蛋白的表达水平较control组有所升高。而给予Irbesartan预处理的细胞,Ang(1-7)激活NOX4蛋白表达的作用明显减弱。而A779能进一步增强Ang(1-7)诱导的NOX4蛋白表达。体内实验结果1.Ang(1-7)减轻BLM诱导的大鼠肺纤维化。大鼠肺组织病理切片HE染色显示,control组大鼠肺脏大致正常,镜下未见炎症细胞浸润和肺间质胶原沉积；BLM组镜下可见部分肺泡壁破坏、塌陷,肺泡间隔明显增厚,炎性细胞浸润,成纤维细胞大量增生,胶原纤维沉积增多。BLM+Ang(1-7)组镜下可见肺泡结构破坏程度较BLM组明显降低,肺泡间隔胶原纤维的沉积和炎性细胞浸润的程度比BLM组轻。BLM+AngⅡ组肺泡结构明显破坏,肺泡炎症和胶原的沉积较BLM组明显增加。BLM组大鼠肺纤维化Ashcroft score评分高于control组,BLM+Ang(1-7)组评分低于BLM组,BLM+Ang Ⅱ组评分明显高于BLM组。Masson染色见,control组大鼠肺间质含有少量染成蓝色的胶原纤维,BLM组肺间质含有大量染成蓝色的胶原纤维,而BLM+Ang(1-7)组肺间质染成蓝色的胶原纤维较BLM组明显减少,BLM+Ang Ⅱ组肺间质蓝色的胶原纤维表达量较BLM组明显增多。2.Ang(1-7)使肾素-血管紧张素系统(RAS)转向ACE2/Ang(1-7)/Mas轴。肺组织局部RAS检测示：BLM组ACE-AngⅡ-AT1R轴主要成分ACE和ATlR mRNA较正常组明显升高,而ACE2-Ang(1-7)-Mas轴主要成分ACE2和Mas mRNA的表达水平较正常组略有所增加,但ACE2和Mas的增加明显低于ACE和ATlR, ACE2/ACE、Mas/ATlR较control组下降；BLM+Ang(1-7)组ACE和ATlR mRNA表达水平较BLM组明显下降,ACE2和Mas mRNA的表达水平较BLM组显著升高,ACE2/ACE、Mas/ATlR比BLM组明显升高；BLM+Ang Ⅱ组ACE和ATlR mRNA较正常组明显升高,ACE2、Mas mRNA、 ACE2/ACE及Mas/ATlR较BLM组均下降。3.Ang(1-7)抑制纤维化大鼠肺组织中NOX4/ROS/Rock2信号通路的激活检测大鼠肺组织氧化物质的表达水平发现：BLM组NOX4蛋白的表达水平和过氧化氢(H202)的含量较control组明显升高,BLM+Ang(1-7)组较BLM组显著下降,BLM+Ang Ⅱ组较BLM组明显增加；RT-PCR检测Rock2mRNA的表达发现BLM组肺组织中Rock2mRNA明显增加,BLM+Ang(1-7)组较BLM组显著下降,BLM+Ang Ⅱ组较BLM组明显增加。结论：1.AngⅡ通过激活NOX4/ROS/Rock2信号通路促进原代肺成纤维细胞迁移和胶原合成。2.Ang(1-7)通过Mas受体抑制Ang Ⅱ对NOX4/ROS/Rock2信号通路激活作用,从而减少原代肺成纤维细胞迁移及胶原的合成。3.Ang(1-7)通过AT1R促进正常原代肺成纤维细胞迁移和胶原合成。4.Ang(1-7)能够显著抑制BLM诱导的大鼠肺纤维化,可能与其抑制ACE/AngⅡ/AT1R轴的表达,上调ACE2/Ang(1-7)/Mas轴的表达有关。5.Ang(1-7)通过抑制NOX4/ROS/Rock2信号通路的活性减轻BLM诱导的肺纤维化。