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第一部分光滑念珠菌感染大鼠气道上皮细胞的研究目的:通过建立光滑念珠菌感染大鼠气道上皮细胞(Rat tracheal epithelia cell,RTEC)的体外模型,观察光滑念珠菌感染RTEC在不同时间点细胞增殖、周期及凋亡的变化,分别在蛋白和细胞水平检测TLR-2、NF-κB(p65)、TNF-α和IL-6表达情况,以探讨TLR-2受体介导的NF-κB(p65)信号通路在光滑念珠菌感染RTEC的研究。方法:RTEC感染光滑念珠菌,感染复数(Multiplicity of infection,MOI)为1。在0h、2h、4h及6h终止感染,分别采用CCK-8(cell counting kit 8,CCK-8)检测细胞存活率。流式细胞仪检测在不同感染时间点细胞周期和凋亡变化情况。Western Blot(WB)方法检测细胞膜表面TLR-2受体及核转录因子NF-κB(p65)在不同感染时间点的表达变化。ELISA方法检测下游细胞因子TNF-α和IL-6在不同感染时间点的分泌情况。结果:CCK-8法检测结果表明,随着时间的延长,光滑念珠菌感染对RTEC的增殖有明显的抑制作用。流式细胞仪检测周期结果显示,光滑念珠菌感染细胞能够使细胞的生长周期阻滞在G0/G1期,抑制细胞的增殖,从而促进细胞的凋亡。采用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,随着感染时间的延长,细胞凋亡的比例显著增加。Western Blot结果表明,随着感染时间的延长TLR-2受体与NF-κB(p65)蛋白表达水平显著增加。ELISA结果表明,TNF-α和IL-6分泌水平也随着感染时间的延长而显著升高。结论:光滑念珠菌感染RTEC能抑制细胞增殖,降低细胞存活率。在静息状态下TLR-2受体表达水平较低,在光滑念珠菌感染的过程中能启动tlr-2受体的表达,并激活核转录因子nf-κb(p65),诱导下游细胞因子和炎症因子tnf-α和il-6的分泌及表达。这一现象可能在rtec应对光滑念珠菌感染的免疫防御调节过程中发挥重要的作用。第二部分sirna干扰tlr-2受体对大鼠气道上皮细胞的影响目的:sirna干扰tlr-2受体对光滑念珠菌感染大鼠气道上皮细胞(rtec)的影响。方法:通过转染sirna抑制rtectlr-2受体(toll-likereceptor2,tlr-2)的表达,构建感染模型,采用与第一部分相同的检测方法,进一步观察转染后感染光滑念珠菌的rtec增殖、周期和凋亡变化情况,以及tlr-2受体、核转录因子nf-κb(p65)、下游细胞因子tnf-α和il-6的表达变化。结果:转染tlr-2sirna的rtec感染光滑念珠菌后进一步抑制细胞的增殖。流式细胞仪检测周期结果表明,细胞在g0/g1生长期的比例增高,细胞生长周期阻滞在g0/g1期,进一步促进细胞的凋亡。采用annexinv-fitc/pi双染色流式细胞仪检测凋亡结果显示,随着感染时间的延长,细胞凋亡的比例显著增加。westernblot及elisa结果均表明,转染后tlr-2、nf-κb(p65)、tnf-α和il-6的表达水平显著降低。结论:tlr-2受体可以启动光滑念珠菌感染rtec的免疫反应,并引起炎症反应,表明是由于tlr-2受体介导的细胞损伤。rtec启动tlr-2受体的表达是建立在tlr-2受体对光滑念珠菌早期识别的基础上,并通过tlr-2--nf-κb下游信号通路启动tlr-2受体的表达。第三部分NF-KB抑制剂PDTC抑制NF-KB的活性对大鼠气道上皮细胞的影响目的:探讨NF-KB抑制剂(PDTC)对光滑念珠菌感染大鼠气道上皮细胞(RTEC)的影响。方法:加入PDTC预处理RTEC 2h后,建立体外感染模型,采用与第一及第二部分相同的检测方法,进一步观察加入PDTC后,感染光滑念珠菌的RTEC增殖、周期和凋亡的变化情况,以及TLR-2受体、核转录因子NF-κB(p65)、下游细胞因子TNF-α和IL-6的表达变化。结果:加入PDTC预处理的RTEC与转染si RNA抑制RTEC TLR-2受体的结果类似,感染光滑念珠菌后均抑制细胞增殖。流式细胞仪检测周期结果表明,细胞在G0/G1生长期的比例增高,细胞生长周期阻滞在G0/G1期,促进细胞的凋亡。采用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测凋亡结果显示,随着感染时间的延长,细胞凋亡的比例显著增加。预处理后的TLR-2受体、核转录因子NF-κB(p65)在前4h表达受到抑制,虽然NF-κB(p65)在第6h有所升高但也只是达到基线水平,TNF-α和IL-6的分泌水平显著降低。结论:TLR-2受体是通过激活NF-κB(p65)信号通路介导光滑念珠菌感染大鼠气道上皮细胞(RTECs)启动天然免疫。