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急性肺损伤是临床觉常见的呼吸系统急危重症之一，感染是该病的主要诱因，G-菌感染致急性肺损伤，主要是由于内毒素(LPS, Lipopolysaccharide)活化炎性细胞释放大量炎症因子所致。研究LPS信号通路及其阻断效应，对帮助了解急性肺损伤的发生机理，寻找急性肺损伤治疗的新靶位，具有重要的理论与实际意义。既往研究表明LPS胞外的信号转导是通过脂多糖结合蛋白LBP呈递给CD+14来实现，而胞内则是通过IL-1受体相关激酶(IL-1 receptor associated kinase ，IRAK)、TNF-α受体相关激酶6(TNF-α receptor associated kinase 6 ，TRAK-6)使IκB激活，活化的IκB再使NF-κB磷酸化后转位，炎症因子(IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-18等)开始转录、翻译和表达。LPS信号由胞外向胞内的转导即跨膜转导一直尚不明确，近年TLR4的发现提供了新的线索，它作为LPS靶细胞膜上的跨膜受体蛋白，其胞外的亮氨酸重复序列可以识别和结合LPS，而胞内与IL-1β同源的尾状结构域，为将LPS信号呈递给IL-1β提供了可能性，故TLR4是LPS信号转导的关键靶分子。TLR4的表达与功能完整直接影响LPS信号传导效能，反之，降低TLR4的表达与功能，有助于减少下游炎症因子的分泌与释放，企以减轻LPS所致的肺损伤。不同个体感染G-菌后临床表现轻重不一,说明个体对LPS的反应性不同，即对ＬＰＳ耐受性(Tolerance or Desensization)存在差异。LPS耐受性机理还不完全清楚，它与机体的免疫力，LPS的内化，LPS信号转导效率等综合因素有关，其中LPS 靶细胞膜上的跨膜受体TLR4的结构与功能及其介导的信号通路，与LPS 耐受性关系尤其密切。TLR4的表达与LPS耐受性的关系尚不明了，研究实有必要。降低TLR4的表达从而提高对LPS的耐受性，有望增强机体对LPS的抵抗力。脂多糖结合蛋白(LBP)是LPS的“载体”，主要负责运送LPS至靶细胞，同时对PS炎症反应具有增敏作用，其抗体可能减轻上述作用，此作用是否与降低LPS信号传导效能有关，值得探究。目前尚无商品化的LBP及抗体，分离、纯化LBP并制备其抗体很有必要。本课题通过以下几个方面研究LBP多抗对LPS急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞TLR4信号通路的影响，为阐明TLR4信号通路在LPS急性肺损伤的作用与地位，LBP<WP=10>抗体治疗LPS急性肺损伤提供理论依据。1. 经50％饱和硫酸铵盐析、Bio-Rex70阳离子交换层析、MonoQ阴离子交换层析从大鼠急性期血清分离、纯化出LBP，并以其免疫新西兰白兔，分离出抗血清后粗制成LBP多抗。为进一步探讨LBP多抗对LPS急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞TLR4信号通路的影响奠定基础。 2. 运用RT-PCR与Western Blot的方法，观察LBP多抗对LPS急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞TLR4基因与蛋白表达水平及下游炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-18基因表达水平变化的作用。从基因与分子水平探讨LBP多抗对TLR4介导的LPS信号通路的影响。3. 运用RT-PCR与Western Blot的方法，观察LPS二次刺激大鼠肺泡巨噬细胞后LPS大鼠肺泡巨噬细胞TLR4基因与蛋白表达及下游炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-10、IL-18基因水平表达的变化及LBP多抗对它们的影响，探讨LPS耐受性与TLR4介导的LPS信号通路的关系及LBP多抗对LPS耐受性的影响。实验结果显示：①从400ml大鼠急性期血清中分离、纯化到1134ug大鼠LBP，纯化倍数达1570倍。纯化的LBP在SDS-PAGE的60KD处呈单一条带，并可明显增强FITC-LPS与ACM的结合。②用纯化的LBP免疫新西兰白兔，经过一周的基础免疫与近三个月的强化免疫，共获得兔抗大鼠抗血清85ml，经饱和硫酸铵梯度盐析、PEG6000浓缩，获得3ml共1560ug多抗，该多抗能阻断LBP与FITC-LPS的结合 ，并经Western Blot检验为LBP多抗。③LBP多抗能降低大鼠肺泡巨噬细胞TLR4基因与蛋白表达水平及IL-1β、IL-10、IL-18、TNF-α基因表达水平。④LPS二次重复刺激大鼠肺泡巨噬细胞后，TLR4基因与蛋白表达水平及IL-1β、IL-10、IL-18、TNF-α基因表达水平均下降，LBP多抗使它们进一步降低。以上结果表明：①经50％饱和硫酸铵盐析、Bio-Rex70阳离子交换层、MonoQ阴离子交换层析可以从大鼠急性期血清分离、纯化到LBP。②用我们纯化的LBP免疫新西兰白兔，三个月后可产生LBP多抗。③LBP多抗能通过降低TLR4的表达，降低TLR4介导的LPS信号转导效能，从而可能减少IL-1β、IL-10、IL-18、TNF-α等炎症因子的分泌。④LPS二次重复刺激大鼠肺泡巨噬细胞，可使其对LPS产生耐受性。⑤LBP多抗进一步降低TLR4介导的LPS信号转导效能，提高大鼠肺泡巨噬细胞对LPS的耐受性，降低LPS介导的炎症反应性，可能提高机体对G-菌感染的抵抗力。⑥LBP多抗具有治疗G-菌感染所致的炎性疾病如SIRS、ALI、ARDS的潜在可能。