紫海杂交扇贝弧菌抗性提高的转录组学分析

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海湾扇贝属瓣鳃纲,异柱目,扇贝科,扇贝属,又被称为大西洋内湾扇贝。海湾扇贝原产于美国东海岸和墨西哥湾沿岸,在1982年由张福绥引进中国,并进行人工养殖,但近年来种质退化的问题严重制约着我国海湾扇贝养殖业的发展,为了改善这一问题,提高扇贝养殖业的经济产量,王春德等于2008年从秘鲁引进了紫扇贝并与海湾扇贝成功杂交,获得了具有优良性状的杂交后代。育种实践和实验结果同时表明,杂交扇贝和海湾扇贝相比,其抗菌性状表现出明显优势,因此研究紫海杂交扇贝的抗弧菌作用机制对于扇贝育种工作具有重要的指导意义。本文构建了海湾扇贝转录组数据库,然后通过转录组测序分析,对海湾扇贝肝胰腺在鳗弧菌感染前后的差异表达基因进行了高通量的鉴定,共发现1045个差异表达基因。通过后续基因注释发现,细菌入侵早期,机体细菌识别相关基因被抑制,细菌受体基因被显著激活。同时机体免疫防御相关基因和抗凋亡,抗氧化相关基因表达显著升高。  本研究主要内容包括:⑴海湾扇贝鳗弧菌感染后6 h,12 h,24 h的肝胰腺基因表达谱结果显示,海湾扇贝的肝胰腺中共有1064个差异表达基因被确定。基于GO注释和已有的参考文献和途径分析,本研究将这些差异表达基因分为四类,其中抗氧化、免疫防御、细胞骨架免疫等相关基因参与了免疫反应,在一定程度上有效防御了病原菌的入侵。为了验证RNA测序的准确性,我们在海湾扇贝中选择了10个在功能富集分析中具有不同的表达模式的基因进行qPCR的验证。qPCR验证结果表明,除了膜联蛋白A7(ANXA7),所有基因的调控方向都是一致的,进一步说明了用于RNA测序的Trinity组装参考转录组和差异表达分析的可靠性和准确性。⑵构建了紫海杂交扇贝转录组数据库,共获取了6 h,12 h,24 h的紫海杂交扇贝肝胰腺基因表达谱。结果显示,在紫海杂交扇贝的肝胰腺中共发现831个差异表达基因。基于GO注释和已有的参考文献和途径分析,本研究将这些差异表达基因分为四类,其中病原菌识别、细胞凋亡与抗氧化、免疫防御、细胞骨架免疫等相关基因参与了免疫反应,有效防御了病原菌的入侵,为后续的扇贝免疫研究和抗病分子选育提供一定的基因资源。⑶组装了包括海湾扇贝、紫海杂交扇贝在内的总参考转录组,并在鳗弧菌感染前后的不同时间点0 h,6 h,12 h,24 h以海湾扇贝为对照,进行了海湾扇贝和紫海杂交扇贝的比较转录谱分析,探究紫海杂交扇贝死亡率低于海湾扇贝的原因。研究结果发现,在鳗弧菌感染前后,有3243个在紫海和海湾扇贝间存在差异的表达基因,通过对紫海杂交扇贝和海湾扇贝进行组内表达模式的差异分析,发现在紫海杂交扇贝和海湾扇贝中存在免疫功能相异的表达基因,并且在紫海杂交扇贝中多存在免疫清除相关的基因,在海湾扇贝中存在较多与炎症反应相关的基因。通过组间表达模式的差异分析,发现紫海杂交扇贝大部分免疫相关基因的表达量远远高于海湾扇贝,说明紫海杂交扇贝具有较强的抗逆性。根据各相关基因参与免疫反应中发挥的作用分为热休克蛋白类,蛋白水解酶类,肌动蛋白类,细胞凋亡与肿瘤坏死因子类,干扰素类,溶菌酶类,凝集素类等。通过对这几类关键基因的研究,初步探讨了海湾扇贝、紫海杂交扇贝的抗弧菌分子机制,为后续的扇贝免疫研究和抗病分子选育提供一定的基因资源。
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