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背景结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是全球第三大最常见的肿瘤,也是死亡率第四位的肿瘤,且发病率呈逐年上升趋势,严重威胁人类的生命和健康,寻找能进一步改善结直肠癌治疗的药物具有重要意义。细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)携带蛋白、mRNA以及多种胞内活性成分,作为细胞间通讯的重要介导,参与细胞间生物信号的传播。细胞外囊泡在肿瘤中的病理生理作用越来越受到关注,可能作为治疗肿瘤的潜在新靶点。自噬是在机体细胞普遍存在,对维持细胞的生存、分化及组织发育具有重要意义,对肿瘤的发生、发展也起重要作用。在自噬过程中,待降解的胞浆组分及细胞器被具有双层膜结构的自噬体(autophagosome,AP)包裹,一部分自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,其所包裹的内容物被降解后得到循环利用,以满足细胞代谢、能量循环、细胞器更新和胞内防御等需要;另一部分自噬体则会被转运至胞外,这部分自噬体往往携带着大量的细胞信息物质,属于细胞外囊泡的一类,介导细胞间的通讯。肿瘤组织中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs),是肿瘤组织中最丰富的免疫细胞。肿瘤相关巨噬细胞可调控肿瘤血管新生、淋巴管生成、转移侵袭和免疫抑制等,在肿瘤的发生发展中具有重要意义。肿瘤相关巨噬细胞有两种亚型,即抗肿瘤的经典活化型(M1型)和促肿瘤生长的替代活化型(M2型),两型可以相互转化。因此,靶向调控肿瘤相关巨噬细胞,使其从M2型向M1型极化,可能是一种重要的抗肿瘤治疗策略。巨噬细胞具有天然的摄取能力,关于肿瘤相关巨噬细胞识别、摄取肿瘤细胞分泌的细胞外囊泡的研究,成为了肿瘤免疫学研究的热点之一。近年来,中医药在结直肠癌的防治中的辅助作用越来越受到关注。复方肠泰(fufangchangtai,FFCT)为江苏省中西医结合医院研制的用于治疗结直肠癌的验方,中医理论认为其有扶正祛邪、益气健脾、清热解毒、消积散结等功效,具有一定的抗肿瘤作用,但其机制尚不清楚。我们既往研究显示,FFCT可诱导结肠癌细胞自噬,鉴于肿瘤细胞自噬、自噬体和肿瘤相关巨噬细胞之间的密切联系,本研究拟探讨FFCT诱导结肠癌细胞产生的自噬体能否极化肿瘤相关巨噬细胞从而抑制结肠癌肿瘤细胞生长,以阐明FFCT抗肿瘤分子机制。目的1.研究FFCT制备及其对结肠癌细胞自噬的影响;2.研究FFCT通过诱导产生的自噬体对小鼠巨噬细胞极化的影响;3.研究FFCT在体内通过诱导自噬、产生自噬体对结肠癌肿瘤生长及肿瘤相关巨噬细胞的影响。方法1.制备FFCT并鉴定。2.通过荧光显微镜、电镜研究FFCT对小鼠结肠癌细胞株CT26.WT自噬及分泌自噬体的影响,并通过westernblot鉴定自噬标志蛋白LC3 Ⅱ的表达。3.通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术研究小鼠巨噬细胞识别、摄取FFCT诱导结肠癌细胞分泌的自噬体,采用流式细胞术、RT-qPCR法、ELISA法检测自噬体对小鼠巨噬细胞极化的影响。4.构建小鼠结肠癌皮下移植瘤模型,观察FFCT在体内对结肠癌细胞自噬和对肿瘤相关巨噬细胞极化的影响。结果1.FFCT中主要成份包括黄芪甲苷0.101 mg/g、齐墩果酸1.107mg/g、熊果酸0.148mg/g、人参皂苷Rg1 0.236mg/g、苦参碱0.056 mg/g、人参皂苷Rb10.249mg/g、甘油三油酸酯0.407mg/g和薏苡素0.200mg/g。FFCT显著抑制结肠癌细胞CT26.WT增殖(P<0.0001),且在一定浓度内呈剂量依赖性。FFCT10mg/ml对CT26.WT增殖无显著影响(P=0.3038)。2.FFCT组可见CT26.WT细胞核周围eGFP-LC3阳性着色,LC3点状聚集形成自噬体;与阳性对照雷帕霉素组类似,FFCT作用后CT26.WT LC3Ⅱ表达量增加,且呈剂量依赖性;电镜检查可见FFCT作用后细胞内自噬体更多,且证实细胞培养液上清中提取的囊泡类物质是具有双层膜结构的、大小不等的膜状小体,结构特点与自噬体相似,western blot证实其含有大量LC3Ⅱ。3.小鼠巨噬细胞加入FFCT诱导结肠癌细胞分泌的自噬体后,巨噬细胞能够有效地摄取DiI标记的自噬体,且巨噬细胞体积明显增大,细胞胞浆内出现不规则形状囊泡,并形成较多伪足,相关分子CD86、CD80、TLR2、TLR4、MHCⅡ的表达明显上调。M1型巨噬细胞相关基因iNOS、TNF-α、MCP-1、IL-6的表达水平明显升高,而M2型巨噬细胞相关基因CD206、IL-10、Arg-1、FIZZ-1的表达水平表达明显降低。培养基上清中的TNF-α、IL-6细胞因子的表达量明显升高。4.小鼠结肠癌细胞皮下移植瘤模型结果显示,FFCT治疗组小鼠体重未受到明显影响(P=0.0524),且瘤体体积及质量较对照组明显减小(P<0.0001、P=0.0008),肿瘤组织中M1型巨噬细胞的数量明显高于对照组。结论FFCT可以诱导结肠癌细胞自噬并分泌自噬体,且自噬体可被巨噬细胞识别、摄取;巨噬细胞摄取自噬体后向M1型极化。本研究初步揭示了 FFCT抗结直肠癌的机制,为开展进一步研究提供了实验基础。