论文部分内容阅读
目的:应用不同浓度替诺福韦酯(Tenofovir disoproxil fumarate,TDF)作用于体外培养PC12细胞(pheochromocytoma),观察替诺福韦酯对PC12细胞存活率、凋亡以及相关指标的影响,探讨替诺福韦酯对神经细胞损伤的作用机制。方法:MTT法检测PC12细胞的生存率;LDH法检测替诺福韦酯对PC12细胞的损伤作用;Hoechst-33342染色观察细胞核凋亡形态的变化;采用原位末端转移酶标记法(TUNEL)和Annexin V-FITC/PI标记染色流式细胞术检测PC12细胞凋亡率;酶标法测定PC12细胞内丙二醛(MDA)的含量;DCFH-DA染色法检测PC12细胞内活性氧(ROS)水平;Western-blot法检测细胞凋亡相关蛋白Bax表达量的改变。结果:替诺福韦酯处理PC12细胞浓度为0μmol/L(对照组)、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L时,细胞存活率分别是100±3.07%、97.29±1.74%、99.08±1.54%、92.47±0.81%、81.86±2.53%和48.74±4.65%,其中替诺福韦酯浓度达到100μmol/L时,较对照组降低,有统计学意义(P<0.05),当替诺福韦酯浓度达到200μmol/L和400μmol/L时,较对照组降低,有显著性差异(P<0.01),提示替诺福韦酯对PC12细胞生长抑制作用呈浓度依赖性。替诺福韦酯处理PC12细胞浓度为0μmol/L(对照组)、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L时,细胞培养液中LDH活性为118.84±17.88、137.87±26.06、144.85±25.26、189.58±24.98、214.51±22.30、262.86±21.71,其中替诺福韦酯浓度达到100μmol/L时,较对照组升高,有统计学意义(P<0.05),当替诺福韦酯浓度达到200μmol/L和400μmol/L时,较对照组升高,有显著性差异(P<0.01),提示替诺福韦酯对PC12细胞的损伤作用呈浓度依赖性。Hoechst-33342染色观察细胞核形态变化结果显示,随着替诺福韦酯浓度增高,显示凋亡特征的PC12细胞数量明显增加,呈现出不同程度的染色质凝聚,核皱缩和凋亡小体形成;TUNEL和Annexin V/PI标记染色流式细胞仪检测显示,替诺福韦酯处理PC12细胞浓度为0μmol/L(对照组)、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L时,细胞凋亡率是1.21±0.45%、11.96±1.64%、33.60±5.87%和51.71±2.50%,其中替诺福韦酯浓度达到100μmol/L时,较对照组升高,有统计学意义(P<0.05);当替诺福韦酯浓度达到200μmol/L和400μmol/L时,较对照组升高,有显著性差异(P<0.01),提示替诺福韦酯具有诱导PC12细胞凋亡作用。应用高内涵活细胞检测系统检测细胞内活性氧的含量变化,替诺福韦酯处理PC12细胞浓度为0μmol/L(对照组)、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L时,细胞内ROS的荧光强度为25540.26±2584.27、37264.90±2098.7、68924.21±330.14和92540.88±4545.79,其中替诺福韦酯浓度达到100μmol/L时,较对照组升高,有统计学意义(P<0.05),当替诺福韦酯浓度达到200μmol/L和400μmol/L时,较对照组升高,有显著性差异(P<0.01);酶标法检测PC12细胞丙二醛含量的结果显示,替诺福韦酯处理PC12细胞浓度为0μmol/L(对照组)、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L时,细胞内丙二醛含量分别为6.64±0.54、8.88±0.78、9.88±0.70和16.22±0.38,其中替诺福韦酯浓度达到100μmol/L时,较对照组升高,有统计学意义(P<0.05),当替诺福韦酯浓度达到200μmol/L和400μmol/L时,较对照组升高,有显著性差异(P<0.01);Western-blot检测结果显示,替诺福韦酯处理PC12细胞浓度为0μmol/L(对照组)、100μmol/L、200μmol/L和400μmol/L时,细胞凋亡相关蛋白Bax相对表达量为1.14±0.04、1.28±0.04、1.61±0.06和2.19±0.07,其中替诺福韦酯浓度达到100μmol/L时,较对照组升高,有统计学意义(P<0.05),当替诺福韦酯浓度达到200μmol/L和400μmol/L时,较对照组升高,有显著性差异(P<0.01),提示替诺福韦酯致PC12细胞损伤与线粒体凋亡通路有关。结论:替诺福韦酯对PC12细胞具有损伤作用,与诱导PC12细胞凋亡有关;凋亡途径与线粒体凋亡通路有关。