A 族链球菌(Group A Streptococcus,简称 GAS)和 B 族链球菌(Group B Streptococcus,简称GBS)是常见的革兰氏阳性致病菌。GAS常定植于人体的咽喉或皮肤部位,其临床症状表现多样性。GAS可以通过直接感染和毒素介导引起一系列临床病症,如咽炎、脓皮病、菌血症、猩红热、链球菌中毒性休克综合征等。GAS还会引起一系列免疫介导性疾病,如风湿热、急性肾小球肾炎、风湿性心脏病等。GBS常定植于女性的阴道,可以导致女性宫内感染、早产、流产。GBS还可以通过产妇的产道感染患儿,引起新生儿严重的细菌性感染,是导致新生儿死亡的主要因素之一。目前,针对细菌性感染的主要治疗方式是使用抗生素,但细菌的耐药性也在逐年增强。除此以外,对于控制GAS和GBS的传播,无症状携带者是一个必须要面对的问题。这部分人不会表现出任何临床病症,但是可以作为携带者将病原体传播给其他易感人群。在控制病原体传播方面,疫苗是我们掌握的最有效的手段。所以,开发针对GAS和GBS的疫苗就显得尤为重要。糖类化合物不仅是生物体重要的能量来源和结构组成部分,还参与多种生物学过程。GAS细胞壁多糖是一类经典的Lancefield抗原,存在于所有GAS血清型中,其结构具有高度保守性,因而被认为是一种潜在的抗GAS疫苗的通用抗原。GBS荚膜多糖分为十种血清型,可以帮助细菌逃逸宿主免疫系统的攻击,是B族链球菌主要的胞外毒力因子之一。GAS细胞壁多糖和GBS荚膜多糖都是研制疫苗的理想糖类靶标抗原。合成结构明确的寡糖片段对于深入研究糖疫苗的功能是十分重要的。一方面,这些合成的寡糖衍生物可以用于糖抗原与糖特异性抗体间构效关系的研究;另一方面,这些合成的寡糖衍生物可以用于开发抗原结构明确的半/全合成糖缀合物疫苗。目前,科研者们已有针对GAS细胞壁多糖苗抗原决定簇的研究和GAS寡糖半抗原糖蛋白缀合物的相关报道。但是,有关GBS荚膜多糖相关寡糖的研究目前仍处于各血清型荚膜多糖重复单元寡糖片段的合成阶段。在本论文中,我们合成了结构明确GAS细胞壁相关寡糖衍生物,并将其与不同载体蛋白缀合,制备了系列半合成GAS寡糖蛋白缀合物,用于相应得免疫学研究。此外,我们还设计并合成了 Ⅵ型GBS荚膜多糖的五糖重复片段,为制备相应的寡糖缀合物奠定了物质基础。本论文主要包括以下三部分内容:一、论文的前言部分对GAS细胞壁多糖和GBS荚膜多糖相关寡糖的合成研究及应用做了详细的综述。(1)在GAS细胞壁多糖相关寡糖的合成和应用方面:目前若干课题组报道了 GAS细胞壁多糖相关寡糖的合成工作,分别利用不同的糖基化策略来合成GAS细胞壁相关多聚寡糖。但是,这些合成路线存在糖基模块组装效率不高、或糖基模块制备过程复杂等问题。同时,免疫学研究表明,GAS三糖分支结构重复单元是糖特异性抗体识别抗原的优势表位,并且GAS细胞壁多聚寡糖蛋白缀合物具有和多糖蛋白缀合物相似的免疫原性,可以诱导T细胞依赖的糖特异免疫反应。(2)在GBS荚膜多糖相关寡糖合成和应用方面:目前已有文献报道了 Ⅰa,Ⅱ,Ⅲ,Ⅴ,Ⅶ,Ⅷ型GBS荚膜多糖重复单元片段及寡糖衍生物的合成研究,尚未发现Ⅰb,Ⅳ,Ⅵ和Ⅸ型GBS的相关合成研究。同时,一项关于Ⅰa型GBS荚膜多糖寡糖蛋白缀合物的免疫学评价研究结果显示,合成的GBS荚膜多糖寡糖衍生物在开发抗GBS糖缀合疫苗方面具有潜在的应用前景。二、论文第二章是关于A族链球菌细胞壁寡糖-链球菌C5a肽酶二价疫苗的合成及免疫活性研究。首先,我们设计合成还原端二糖受体,硫苷中间体三糖和鼠李糖供体三个糖基组装模块,其中二糖受体和三糖中间体可以通过同一个二糖前体合成。我们通过[2+1]、{2+[3+1]}和{[2+3]+[3+1]}的糖基化策略,高效且收敛地组装合成了结构明确、含有不同寡聚度的目标GAS三、六和九糖衍生物。接着,我们将所合成的三组寡糖衍生物的还原端氨基与双琥珀酰戊二酸酯反应制备糖基活化酯,分别与载体蛋白ScpA193、CRM197、TT和BSA偶联制备系列寡糖蛋白缀合物,用于免疫活性研究。其中,CRM197组和TT组的糖蛋白缀合物用于作为评价ScpA193组糖蛋白缀合物的阳性对照;BSA的糖蛋白缀合物作为铺板抗原,用于检测糖特异性抗体。此外,我们还利用方酸二乙酯和HSA制备另一类三糖铺板抗原,用于评价戊二酰基连接臂的免疫原性。最后,我们对合成的糖蛋白缀合物进行了免疫活性的评价。初步的免疫学评价结果表明,对比使用传统载体如CRM197和TT制备的寡糖蛋白缀合物,GAS寡糖-ScpA193糖蛋白缀合物不仅可以诱导产生近似或更强的糖抗原特异性免疫应答,还能够诱导产生针对野生型链球菌C5a肽酶的高滴度特异性抗体的表达。制备这些糖蛋白缀合物时使用的戊二酰基连接臂不具有显著的免疫原性。这些结果表明,GAS寡糖-ScpA193糖蛋白缀合物是一种新型二价抗GAS疫苗候选物,值得进行进一步深入研究。三、论文第三章是关于Ⅵ型B族链球菌荚膜多糖重复单元五糖衍生物的合成研究。我们通过化学法完成了 Ⅵ型GBS荚膜多糖的五糖片段的首次合成。在糖基模块的准备过程中,我们直接利用天然存在的乳糖构建还原端受体二糖。这样可以减少后续糖基模块组装过程中糖基化的次数,并且简化了糖基模块的制备过程。在乳糖模块构建过程中,我们尝试对乳糖衍生物引入亚异丙基的反应条件进行优化,并获得良好的收率。我们参照现有方法合成了含有α-糖苷键的唾液酸二糖硫苷供体。此外,我们还设计合成了含有双临时保护基的硫苷葡萄糖中间体,用于唾液酸二糖供体和还原端二糖受体的连接。随后,我们采用{2+[1+2]}的糖基化策略对各糖基模进行组装。在糖基模块的组装过程中,我们利用糖基供体中2-位苯甲酰基的邻基参与效应,高效地构建了各合成模块之间1,2-trans-反式糖苷键。在还原端三糖模块的合成中,我们利用受体3,4-位羟基活性的差异并且通过反应条件的控制顺利构建新生成的β-(1→3)糖苷键。在合成五糖时,我们尝试多种糖苷化催化体系均不能有效催化唾液酸二糖硫苷供体和三糖受体间的糖苷化反应。为了克服这一困难,我们将硫苷供体转化为活性更好的三氯乙酰亚胺酯供体。最后,我们利用新的唾液酸二糖供体与三糖受体进行糖苷化反应顺利合成全保护五糖。在合成的全保护五糖分子中,TBDPS作为临时保护基可以被选择性脱除,脱出后的羟基可以作为糖链延长的起点。最后经过四步脱保护反应,我们顺利得到目标五糖化合物。本论文主要以A族链球菌寡糖蛋白缀合物和Ⅵ型B族链球菌荚膜多糖重复单元五糖衍生物合成为研究目标,主要取得以下几个方面的创新点:(1)根据GAS细胞壁多糖中分支结构三糖重复单元,我们设计了结构明确的三、六、九糖作为半抗原。针对目前合成研究中模块组装效率不高和模块合成路线繁琐的问题,我们利用一个相同二糖前体衍生合成还原端二糖受体和三糖中间体模块,通过[2+1]、{2+[3+1]}和{[2+3]+[3+1]}的糖苷化策略,高效且收敛的合成了目标寡糖化合物。(2)基于糖缀合疫苗激活特异性免疫反应的机理,我们利用失活的GAS胞外毒力因子ScpA突变体ScpA193作为载体蛋白,制备了 GAS细胞壁寡糖蛋白缀合物。初步免疫学活性评价证明,这类新型寡糖蛋白缀合物可以同时引起针对寡糖抗原和毒力因子ScpA的特异性抗体应答。(3)我们采用{2+[1+2]}的糖苷化合成策略,首次实现了Ⅵ型GBS荚膜多糖五糖重复片段的化学合成,为其他研究工作者提供了参考。