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目的:研究蟛蜞菊内酯(wedelolatone)对小鼠烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus,A.fumigatus)性角膜炎炎症反应的影响和作用机制。方法:1.蟛蜞菊内酯预处理对小鼠真菌性角膜炎的影响:小鼠随机分为药物组和感染组,均采用角膜基质内注射烟曲霉菌孢子(2ul,浓度0.5×10~5/μL)的方法建立真菌性角膜炎模型。药物组在建模前1天及建模前球结膜下注射5ul浓度为30μM的蟛蜞菊内酯,感染组用同样方法给予DMSO预处理。建模后第1、3天裂隙灯下拍照观察小鼠角膜感染情况并记录临床评分。采用免疫荧光法特异性标记中性粒细胞,采用髓过氧化物酶法(myeloperoxidase,MPO)定量检测中性粒细胞,分析蟛蜞菊内酯对小鼠角膜基质内中性粒细胞募集情况的影响。2.蟛蜞菊内酯影响小鼠真菌性角膜炎的作用机制:小鼠随机分为感染对照组、感染组、药物对照组和药物组。药物对照组和药物组在建模前1天及建模前球结膜下注射5ul浓度为30μM的蟛蜞菊内酯,感染对照组和感染组用同样方法给予DMSO预处理。感染对照组和药物对照组仅行预处理,感染组和药物组在预处理后采用角膜基质内注射烟曲霉菌孢子的方法建立真菌性角膜炎模型。建模1天后采用聚合酶链式反应(reversetranscription-PCR,RT-PCR)法检测各组小鼠角膜中促炎因子IL-1βmRNA的表达,采用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)法检测各组小鼠角膜中抗真菌模式识别受体Dectin-1、LOX-1和促炎因子IL-1β(前体和成熟体)蛋白的表达。3.蟛蜞菊内酯影响真菌感染的人THP-1巨噬细胞的作用机制:采用PMA诱导人THP-1细胞成为巨噬细胞,将细胞分为4组,分别为感染对照组、感染组、药物对照组和药物组。药物对照组和药物组在建模前2小时加入蟛蜞菊内酯(终浓度为10μM)预处理,感染对照组和感染组用同样方法给予DMSO预处理。感染对照组和药物对照组仅行预处理,感染组和药物组在预处理后给予烟曲霉菌分生孢子刺激建立细胞感染模型,感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1。模型建立4小时收集细胞,用PCR法检测各组小鼠角膜中促炎因子IL-1βmRNA的表达,16小时收集细胞,用于Western Bolt法检测各组小鼠角膜中抗真菌模式识别受体Dectin-1、LOX-1和促炎因子IL-1β(前体和成熟体)蛋白的表达。4.蟛蜞菊内酯影响IL-1β的作用机制:采用角膜基质内注射烟曲霉菌孢子的方法建立小鼠真菌性角膜炎模型,在建模后1/2,1,2,3和5天收集小鼠角膜,采用Western Bolt法对各个阶段小鼠角膜中半胱氨酸蛋白酶-1(cysteine-aspartic proteases-1,caspase-1)的激活情况进行定量检测,采用Western Bolt法对实验2中各组小鼠角膜中caspase-1的激活情况进行定量检测。5.蟛蜞菊内酯在治疗小鼠真菌性角膜炎中的作用:小鼠随机分为治疗组和联合治疗组,均采用角膜基质内注射烟曲霉菌孢子的方法建立真菌性角膜炎小鼠模型,联合治疗组在建模后第1天球结膜下注射5ul浓度为30μM的蟛蜞菊内酯,治疗组用同样方法给予DMSO对照。两组均给予那他霉素滴眼液(Natacyn,Alcon Laboratories)滴眼,滴两天时间,每日四次。裂隙灯下观察小鼠角膜感染情况并记录临床评分。结果:1.蟛蜞菊内酯预处理对小鼠真菌性角膜炎的影响:与感染组相比,蟛蜞菊内酯干预药物组小鼠角膜在烟曲霉菌感染后第一天炎症反应程度较感染组轻,临床评分较感染组低,第三天炎症反应较感染组重,临床评分较感染组高;感染后第一天,中性粒细胞免疫荧光染色及MPO检测显示,与感染组相比,蟛蜞菊内酯干预组小鼠角膜基质内中性粒细胞数目减少,MPO活性下降,差异具有统计学意义。2.蟛蜞菊内酯影响小鼠真菌性角膜炎的作用机制:蟛蜞菊内酯下调小鼠烟曲霉菌性角膜炎中角膜的IL-1βm RNA水平以及抑制成熟IL-1β蛋白的表达,然而其并不影响小鼠角膜中抗真菌模式识别受体Dectin-1、LOX-1蛋白的表达以及IL-1β前体蛋白的表达。3.蟛蜞菊内酯影响真菌感染的THP-1细胞的作用机制:蟛蜞菊内酯下调真菌感染的THP-1细胞的IL-1βmRNA水平以及抑制成熟IL-1β蛋白的表达,抗真菌模式识别受体Dectin-1、LOX-1蛋白的表达以及IL-1β前体蛋白的表达不受蟛蜞菊内酯预处理影响。4.蟛蜞菊内酯影响IL-1β的作用机制:Caspase-1在烟曲霉菌性角膜炎中的表达水平从开始至第一天逐渐增加,而后开始下降。蟛蜞菊内酯预处理的药物组中,小鼠角膜内caspase-1的表达较感染组明显降低。5.蟛蜞菊内酯在治疗小鼠真菌性角膜炎中的作用:蟛蜞菊内酯处理的烟曲霉菌性角膜炎与对照组相比,小鼠角膜透明度高,临床评分降低。结论:1.蟛蜞菊内酯预处理减少小鼠烟曲霉菌性角膜炎时角膜区域中性粒细胞的募集。2.蟛蜞菊内酯通过下调Caspase-1的活性,抑制IL-1β的成熟。3.蟛蜞菊内酯联合抗真菌药物有助于维持小鼠烟曲霉菌性角膜炎的角膜透明性。