循环衰竭是导致重症失血性休克（hemorrhagic shock,HS）顽固性低血压ǎ多器官损伤的重要因素,是重症休克患者死亡的主要原因ǐ淋巴循环是循环系统的重要组成部分,对于维持机体稳态起着重要的作用ǐ研究发现,失血性休克时,血液循环障碍的同时也出现淋巴微循环障碍,表现为淋巴管收缩性降低,并加重不可逆休克的恶化ǐ淋巴微循环功能与重症休克的发展关系密切ǐ由于淋巴管收缩是淋巴循环的动力学基础,因此,淋巴管低收缩性在休克发病学中的作用值得关注,淋巴管低收缩性的发病机制也有待深入研究ǐ生物活性分子一氧化氮（nitric oxide,NO）在休克的发展进程中发挥着重要作用,参与了重症休克血管低反应性以及器官损伤的发生;研究也表明,NO的周期性变化参与了淋巴管生理状态下的收缩ǎ舒张以及张力调节ǐ这使我们考虑:NO是否参与休克后淋巴管收缩性的调节项目组前期研究发现,随着休克进程的推进,淋巴管收缩性对于升压药物的反应性下降,即“淋巴管低反应性”,那么,NO是否与休克淋巴管低反应性有关亟待研究ǐ为了更好地研究休克发展进程中淋巴管收缩性的变化,我们采用微血管压力-直径测定技术建立了离体淋巴管收缩性观察的技术平台,离体观察失血性休克后不同时间淋巴管的收缩性变化及其对调节淋巴管收缩活性的P物质（substance P,SP）的反应性变化,丰富了休克淋巴微循环障碍的基础理论;同时,观察了NO/NOS工具药对休克淋巴管收缩性和对SP反应性的影响,为休克淋巴管收缩性的调控提供实验依据与理论基础ǐ首先,应用Wistar雄性大鼠48只,随机均分为对照组（仅麻醉ǎ手术）ǎ休克组（经股动脉放血,维持平均动脉压40 mmHg,复制失血性休克模型,分为shock 0h shock 0.5hshock 1hshock 2hshock 3h五个亚组）,均n=8ǐ利用离体淋巴管分离技术,在对照组完成手术稳定30min后休克大鼠各时间点,分离胸导管,手术显微镜下分离干净胸导管周围组织,制备淋巴管条,移入微血管压力-直径测定仪的浴槽内固定孵育,待淋巴管出现稳定的自发性收缩后,观察淋巴管在不同跨壁压（1 cmH₂O3 cmH₂O5 cmH₂O7 cmH₂O9 cmH₂O）下的收缩频率（contraction frequency,CF）收缩末期口径（end systolic diameters,ESD）舒张末期口径（end diastolic diameters,EDD）被动管径（passive （relaxed） diameters,PD）的变化,根据检测的淋巴管各口径和频率,以紧张指数（tonic index,TI）收缩幅度（contraction amplitude,CA）泵流分数（fractional pump flow,FPF）等指标,结合CF作为评价淋巴管活性的指标ǐ其中:TI=（PD-EDD）/PD×100%;CA=（EDD-ESD）/PD×100%;FPF=（EDD²-ESD²）/EDD²×CFǐ结果显示,在多个跨壁压下,shock 0hshock 0.5h淋巴管的CFTIFPF显著高于对照组,随着休克的发展,shock 2h和shock 3h淋巴管的CFTIFPF明显降低,与对照组具有统计学差异;而在各跨壁压下,失血性休克后各时间点淋巴管的CA与对照组均未见明显差异ǐ结果表明,失血性休克过程中淋巴管的收缩性呈双相变化,即早期收缩性增高,后期为低收缩性;同时发现,跨壁压过大对于淋巴管活性的恢复不利,在3 cmH₂O下,淋巴管收缩活性最好,这为下一步的实验研究奠定了方法学基础ǐ其次,应用36只Wistar雄性大鼠随机分为对照shock 0hshock 0.5hshock 1hshock 2hshock 3h共6组（均n=6）ǐ按前述方法,在各组在相应时间点分离胸导管,制备淋巴管条,在3 cmH₂O跨壁压下行离体灌流,分别给予从低到高浓度的SP(依次为10^-8 mol·L^-1、3×10^-8 mol·L^-1、10^-7 mol·L^-1、3×10^-7 mol·L^-1),测量淋巴管的EDDESDCF和PD,计算CAFPF和TI,观察SP对休克淋巴管收缩性的调控作用ǐ结果发现,SP对各组淋巴管的CFTIFPF均有提升作用,且随着SP浓度的增加,这种作用也逐渐增强;SP浓度自3×10^-8 mol·L^-1起,已将休克2h和3h淋巴管的CFTIFPF提升至或超过实验前对照组水平ǐ同一浓度下,SP对各组淋巴管CA的影响无统计学差异,但随着SP浓度增高,各组淋巴管CA值出现了下降趋势ǐ结果表明,SP不仅具有增强生理状态下淋巴管泵活性的作用,更重要的是可增加休克各期淋巴管泵的功能;同时也表明,SP可作为研究休克淋巴管收缩性的活性药,这为下一步研究休克淋巴管的反应性提供了实验基础ǐ进一步将给予SP后淋巴管的CFTICAFPF与未加SP前的CFTICAFPF的差值CFTICAFPF作为评价淋巴管对SP反应性的指标,观察休克离体淋巴管对SP反应性的变化ǐ结果发现,shock 0h与shock 0.5h大鼠淋巴管对多个或一个SP浓度的CFTICAFPF显著高于对照组,shock 2h淋巴管对SP的CF(3×10^-7 mol·L^-1)TI(1×10^-7 mol·L^-1)以及shock 3h淋巴管对SP的CF(1×10^-7 mol·L^-13×10-7 mol·L^-1)TI(1×10^-7 mol·L^-1)CA(1×10^-7 mol·L^-1)均显著低于对照组ǐ结果提示,休克淋巴管对SP反应性亦呈双相变化,即早期升高,晚期降低;同时,也提示休克淋巴管反应性变化是收缩性改变的重要机制,重症休克淋巴管的低反应性是其收缩性下降的原因之一ǐ最后,为了观察NO对失血性休克大鼠离体淋巴管收缩性与反应性的影响,首先应用Wistar雄性大鼠随机均分为对照组Shock组（复制HS模型,分为休克0h0.5h1h2h3h亚组）,留取胸导管组织,用于iNOS活性检测ǐ结果发现,随着休克发展,iNOS蛋白表达逐渐降低ǐ再使用Wistar雄性大鼠24只,复制失血性休克模型（shock 0.5hshock 2h各12只）,制备淋巴管条,维持淋巴管跨壁压为3 cmH₂O,待淋巴管出现稳定的自发性收缩后,shock 0.5h淋巴管分别与NO供体L-Arg(1×10^-3 mol·L^-1)L-Arg+可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ(1×10^-5 mol·L^-1)孵育（分别为shock 0.5h+L-Argshock 0.5h+L-Arg+ ODQ组,n=6）;shock 2h大鼠的淋巴管分别与NOS抑制剂L-NAME(1×10^-7 mol·L^-1)L-NAME+磷酸二酯酶抑制剂氨茶碱(aminophylline,AP,1×10^-5 mol·L^-1)孵育（分别为shock 2h+L-NAMEshock 2h+L-NAME+AP组,n=6）各5 min后,观察并记录淋巴管的CFEDDESDPD,计算TICAFPF等淋巴管收缩性指标ǐ以前述对照shock 0.5hshock 2h组的淋巴管在不加任何药物直接观察淋巴管的收缩性指标作为对照,评价NO对休克淋巴管收缩性的作用ǐ结果发现,L-Arg可降低shock 0.5h淋巴管的CFTIFPF至对照组水平;ODQ可抑制L-Arg的作用,显著升高淋巴管的CFTIFPF,但CFFPF仍低于shock 0.5h组ǐL-NAME可提升shock 2h淋巴管的CFTIFPF,恢复到对照组水平;AP可抑制L-NAME的作用,显著降低淋巴管的CFTIFPF,使CFTI较shock 2h组更为低下ǐ但这些工具药均未对淋巴管CA发挥明显作用ǐ研究结果提示,NO在休克淋巴管收缩性双相变化中具有显著的调节作用,其作用机制可能与调节cGMP水平有关ǐ记录shock 0.5hshock 2h淋巴管与相应工具药孵育后的基础数值之后,在各组淋巴管与工具药孵育后的10 min,在浴槽中依次从低到高浓度加入SP母液,使终浓度为1×10^-8 mol·L^-13×10^-8 mol·L^-11×10^-7 mol·L^-13×10_-7 mol·L^-1,然后分别记录CFEDDESDPD,计算TICAFPF等收缩性指标ǐ以对照shock 0.5hshock 2h各组淋巴管在加入不同浓度SP后的CFTI CA FPF作为对照,评价NO对休克淋巴管反应性的作用ǐ结果发现,L-Arg可显著降低shock 0.5h淋巴管对多个SP浓度点的CFTI与FPF;ODQ可显著抑制L-Arg的作用,在某些SP浓度点上,使CFTIFPF显著高于shock 0.5h+L-Arg组,CFFPF高于对照组水平ǐL-NAME均可提高shock 2h淋巴管对多个SP浓度点的CFTI与FPF,且高于对照组水平;shock 2h淋巴管与L-NAME和AP同时孵育后,在SP为1×10^-8 mol·L^-13×10^-8 mol·L^-1时,AP显著抑制L-NAME的作用,使CFTI与FPF均明显低于shock 2h+L-NAME组ǐ结果提示,NO参与了休克淋巴管反应性的双相调节,其机制可能是通过cGMP实现的ǐ综上,在失血性休克的发展进程中,离体淋巴管收缩性与反应性均出现了早期升高晚期降低的双相变化,淋巴管反应性是淋巴管收缩性变化的重要机制;NO参与了休克淋巴管收缩性与反应性的双相调节,其作用机制可能与cGMP有关;以NO作为药物靶点,可调节休克淋巴管的收缩性,研究结果为休克淋巴管的调控提供了重要的实验依据与理论参考ǐ