牛作为重要的经济动物,其多能性干细胞具有广阔的应用价值,是具有重要研究意义的生物材料,如用于基因工程、胚胎工程和克隆技术研究等方面。尽管经过了很多的尝试,到目前为止,仍然没能有效建立牛的多能干细胞系。最近,有研究报道了从人的皮肤成纤维细胞和间充质干细胞中分离到一种新的干细胞类型,命名为Muse细胞,它具有自我更新和多向分化的潜能,可以向三胚层细胞分化,展现了一定程度的多能性。本研究尝试利用免疫磁珠分选技术和酶消化法从牛的胎儿成纤维细胞中分离这种具有一定多能性的Muse细胞,为进一步研究牛的干细胞的分化、基因调控以及重编程提供细胞模型。研究内容如下:1.利用SSEA4作为标记免疫磁珠法分选牛皮肤源Muse细胞通过免疫荧光染色证实牛胎儿成纤维细胞中存在少量表达SSEA4的细胞,利用SSEA4免疫磁珠抗体进行分选,从牛胎儿成纤维细胞中分选出约2?3%的SSEA4阳性细胞。阳性细胞呈三角或多角形,较小,具有较高的核质比。检测结果显示其表达碱性磷酸酶(AP)、Oct4、Nanog、Sox2、SSEA4等多能性相关标记物并能向三胚层细胞分化,但裸鼠实验不能形成畸胎瘤。此外,SSEA4阳性细胞还表达CD105和其它间质细胞的标记,也能够向脂肪、骨和软骨细胞分化。2.胰酶消化法分离牛皮肤源Muse细胞对0.25%胰酶/EDTA应激处理牛胎儿成纤维细胞获得Muse细胞进行了探索,结果表明随着处理时间的增加,细胞的多能性相关标记表达不断增强,处理12 h所获得的Muse细胞最强;处理12 h获得的Muse细胞极少,贴壁后呈圆形、三角或多角形,并对其进行了培养。经过检测,Muse细胞表达AP、Oct4、Nanog、Sox2、c-Myc以及SSEA4等多能性标记,但端粒酶活性较低,也具有向三胚层分化的能力,裸鼠实验也不能形成畸胎瘤。通过透射电镜和WB检测,胰酶应激处理过程中存在自噬的发生,并且随着处理时间的增加,LC3的表达量逐渐增加。3.Muse细胞培养条件的优化通过比较4 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、100 ng/mL浓度的bFGF对于Muse细胞增殖的影响及多能性的影响,发现高浓度的bFGF(10ng/mL以上)对Muse细胞的增殖有明显的促进作用,BrdU掺入实验也证明20 ng/mL和40 ng/mL的浓度效果较好;AP染色和QRT-PCR结果表明40 ng/mL的bFGF更有利于提高Muse细胞多能性相关标记物的表达水平。对Muse细胞进行了悬浮培养,超低吸附皿形成的细胞球大小不均匀,容易发生融合,而且成本较高,采用甲基纤维素悬浮培养在PolyHEMA包被的培养板中形成的细胞球更加均一,此外,经过检测,甲基纤维素悬浮培养有利于进一步纯化Muse细胞和维持其未分化状态,可以作为Muse细胞长期培养的方法。4.Muse细胞核移植胚胎体外发育潜能的研究用SSEA4+细胞、SSEA4-细胞以及胎儿成纤维细胞作为核供体细胞进行了核移植试验,结果显示,SSEA4+组的克隆胚胎的卵裂率为85.62%,显著高于SSEA4-组的66.32%和对照组的70.36%;SSEA4+组第7 d克隆囊胚率为40.16%,也显著高于SSEA4-组的27.42%和对照组的32.45%。SSEA4+组囊胚的胚胎细胞总数、TE细胞数、ICM细胞数以及ICM:TE的比值都显著高于SSEA4-组胚胎。SSEA4+组囊胚的胚胎细胞总数和ICM:TE的比值也显著高于对照组胚胎。各组囊胚的质量和囊胚的凋亡率的结果显示,SSEA4+组囊胚的细胞凋亡率(2.67±0.32%)显著低于SSEA4-组(3.68±0.37%)和对照组胚胎(3.05±0.43%)。SSEA4+细胞为供体细胞的囊胚质量明显高于SSEA4-细胞和成纤维细胞。SSEA4+细胞作为供体细胞有利于克隆胚胎的体外发育。