利用基因突变的方法研究青蒿倍半萜合酶催化特异性决定区域

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萜类是是指具有(C5H8)n通式的烃类及其含氧衍生物,可以看成是由异戊二烯或者异戊烷以各种不同方式连结而成的一类天然化合物。迄今为止,人们已经从自然界中各种生物里分离鉴定了55,000多种萜类化合物。  本实验对青蒿(Artemisia annua L.)两种倍半萜合酶:紫穗槐二烯合酶(Amorpha-4,11-diene Synthase, ADS)和柏木脑合酶(Epi-cedrol Synthase, ECS)的C末端结构通过重叠延伸 PCR法进行互换,构建出杂交分子,得到的产物失去了催化活性。说明C末端结构对酶活性有重要作用。  对青蒿紫穗槐二烯合酶通过快速定点突变法引入突变,研究酶的催化特异性变化。此方法所表达的蛋白失去了催化紫穗槐二烯合酶的活性,得到了催化底物产生红没药烯(β-Bisabolene)的新活性。突变的氨基酸残基与原来的氨基酸具有不同的性质,可使酶的催化活性发生改变。可为进一步研究紫穗槐二烯合酶的催化特异性决定位点奠定基础。  利用反转录方法得到青蒿大根香叶烯合酶移码突变的cDNA插入到原核表达载体pET-21中,构建带有 His标签的表达载体 pETG。将 pETG转化入大肠杆菌 Rosetta(DE3)中诱导表达蛋白,表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化产物蛋白加入酶促反应体系(FPP)。经 GC-MS分析显示酶有催化 FPP形成 farnesol的活性。
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