阿魏菇凝集素分离纯化及性质研究

来源 :石河子大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:yeshi804883653
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本文选用新疆特色资源阿魏菇为对象,对其分离纯化、理化性质及部分免疫活性进行研究。①阿魏菇凝集素(pleurotus ferulae Lectin,PFL)的分离纯化采用PBS(phosphate buffer saline)浸提、硫酸铵分级沉淀、超滤浓缩、离子交换层析初步分离以及琼脂糖凝胶亲和层析法纯化的方法提取出了纯度较高的PFL。选用的层析柱长为36cm,直径为1.1cm,离子交换层析选用DEAE-cellulose52,柱材料与填料比为3:1;亲和层析的填料为NaOH活化过的Sepharose-4B,柱材料与填料比为1:1,用PBS平衡液洗脱杂蛋白至A280<0.02,收集洗脱液透析处理,经过电泳实验无蛋白条带;再用0.25mol/L D-半乳糖溶液解吸附至A280<0.02,流速为1mL/min,收集洗脱液透析,电泳,观察到单一蛋白条带电泳,表明PFL是由单一亚基组成的单聚体,并证实得到纯度较高的PFL。②PFL电泳SDS-PAGE和非变性PAGE结果均得到单一蛋白带,分子量17.5kDa左右,考马斯亮蓝R-250绘制标准曲线测得阿魏菇凝集素蛋白含量为84.33%。Native-PAGE是在不破坏蛋白的天然结构和电荷的条件下,依据天然蛋白自身所带电荷和在电场与介质中泳动,可以鉴定分离到的蛋白的纯度,同时有利于蛋白的回收利用。③PFL凝血活性研究阿魏菇凝集素的最高凝集效价为28;温度在0-60℃,凝血活在70℃以上稳定,凝血活性完全消失,证明该PFL不耐高温;凝集素在pH环境高于2的酸性环境中稳定,pH>10以上的碱性环境下,凝集素凝血活性全部消失;凝集素活性随盐度升高而增加,D-半乳糖可以有效的抑制PFL凝血活性,金属离子Zn2+显著增强凝集素的凝血活性。④PFL的基础免疫活性研究观察凝集素对小鼠脾淋巴细胞增殖的作用。采用MTT法,以不同浓度的凝集素与脾淋巴细胞共孵育48h,二甲基亚砜终止培养,测定细胞培养液的吸光度值,检测凝集素对淋巴细胞的增殖作用。由结果可知小鼠淋巴细胞的增殖作用与凝集素呈剂量依赖关系,添加量仅为80μg/mL,就有显著的增殖作用。阿魏菇凝集素还能促进小鼠腹腔巨噬细胞产生NO,NO水平的增加使巨噬细胞发挥其免疫调节作用和杀伤肿瘤的功能,凝集素浓度在40μg/mL及以上便可以刺激巨噬细胞产生大量的NO,增强器免疫活性。以上结论为阿魏菇凝集素免疫调节活性的研究提供了理论依据。
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