论文部分内容阅读
[背景目的]尤文肉瘤(Ewing’s sarcoma, EWS)是儿童和青少年第二大常见的原发性恶性骨肿瘤,平均发病年龄在15岁,是尤文肉瘤家族肿瘤(ESFT)的重要一员。EWS具有高转移的特性,约25%的患者在诊断时已发生转移。此外,EWS患者的预后很不乐观,转移或复发的EWS患者,5年无病生存率仅为10%-20%。因此,寻找新型的生物预后标记物对EWS患者至关重要。EZH2(enhancer of zeste homolog2)是果蝇zeste基因增强子的人类同源基因,属pcG (polycomb group)基因家族的重要成员之一,在癌症的发生发展中发挥了重要作用。EZH2基因通过特定的SET结构域对核小体组蛋白H3的27位赖氨酸(H3K27)进行甲基化修饰,然后触发PRC1复合物成分在特定基因位点聚集从而导致下游靶基因沉默,包括抑癌基因的沉默等。近年来研究发现,EZH2在前列腺癌、乳腺癌、膀胧癌、肝细胞癌、大肠癌、胃癌等多种恶性肿瘤中高表达。但是目前尚未有报道涉及EZH2在EWS患者组织中的表达及对预后的影响。微小RNA (microRNAs, miRNAs)是一类内源性的单链非编码小分子RNA,约有18-25个核苷酸分子。通过与多种靶基因3’-UTR区配对,调控下游靶基因的表达,在恶性肿瘤发生发展中发挥了重要作用。miRNAs即可以作为癌基因促进恶性肿瘤的进展,也可以发挥抑癌基因抑制肿瘤的生长。本课题研究的目的是检测micoRNAs在EWS中的差异性表达,分析miR-127-3p 与 P53、Ki-67和EGFR肿瘤分子的相关性及病人各临床病理参数之间的关系,为EWS患者发现新的治疗靶点和生物预后标志物提供实验依据。本论文主要从以下二部分进行研究：1、miRNAs在EWS组织中的差异性表达及miR-127-3p与P53、EGFR和Ki-67肿瘤分子的相关性分析及临床意义探讨2、EZH2在EWS组织中的表达特征及预后相关性分析。[研究方法]收集81例尤文肉瘤／原始神经外胚层肿瘤(Ewing sarcoma/pr--imitive neuroectodermal tumor, EWS/PNET)和其他小圆细胞恶性肿瘤石蜡标本并构建组织芯片,使用荧光原位杂交(FISH)检测尤文肉瘤断裂位点1(EWSR1)基因易位；分别选择3例生存时间不足一年和超过3年的石蜡标本送公司做microRNAs芯片,寻找EWS组织中差异表达的microRNAs;应用免疫组织化学法检测肿瘤组织标本中EZH2,P53、Ki-67和EGFR的表达,并分析miR-127-3p和EZH2与P53、Ki-67、EGFR的相关性,以及与EWS患者预后的关系,从而发现新型生物预后标记物。EZH2和miR-127-3p对细胞功能的影响通过增殖、迁移、侵袭等试验来检测。[结果分析]1、microRNAs芯片结果显示多个差异表达的microRNAs,根据P值和信号值的大小,选择前五个microRNAs(hsa-miR-127-3p,hsa-miR-369-5p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-376c-3p, hsa-miR-497-5p)进行验证,发现miR-127-3p的表达与EWS患者的预后关系最为密切,并具有统计学意义(p=0.002),且miR-123-3p的表达与生存时间相关(p=0.002)。Cox多因素分析显示,miR-127-3p可以作为EWS患者预后的独立危险因子(HR:0.328,HR：0.102-1.055,P=0.016)。在细胞水平上,miR-127-3p可以抑制EWS细胞的迁移和侵袭能力,提示miR-127-3p在EWS发生发展中起抑癌基因的作用。结果发现EZH2与miR-127-3p具有负相关关系。2、EZH2蛋白在EWS组织中的高表达与肺转移(p=0.046)、生存时间(p=0.004)及Ki-67的表达密切相关(P=0.007)。K-M分析显示,EZH2高表达与患者不良预后显著相关(P=0.006)；Cox多因素分析表明,EZH2是影响患者总体生存的独立预后判定因子(HR=3.467,95%CI=1.138-10.563,P=0.029)。细胞水平上,我们发现EZH2干扰后明显降低了EWS细胞的迁移、侵袭和增殖能力,提示EZH2在EWS发生发展中发挥癌基因的作用。[实验结论]EZH2和miR-127-3p可以作为判断EWS预后的新型生物标志物,并有可能成为EWS治疗的分子靶点。同时,miR-127-3p可以抑制EWS的发生和发展过程,发现EZH2和miR-127-3p具有一定的负相关关系。