增强子捕获技术是研究功能基因组一种重要研究手段,是鉴定基因表达重要调控元件—增强子的有效方法。利用该技术建立的增强子捕获文库,可用于挖掘基因组中未知的增强子,并且研究其对基因时空表达模式的调控作用。转座子是基因组上可自主移动的基因,被广泛作为基因转移的非病毒整合载体。转座子介导的增强子捕获技术显著提高了捕获效率,已经在斑马鱼、小鼠、果蝇等模式生物中得到广泛应用,但仍存在较多技术细节需要完善。本研究针对目前转座子介导的增强子捕获和验证研究中存在的问题,利用模式动物斑马鱼和哺乳动物细胞,优化基础启动子及构建并优化双向增强子捕获载体、哺乳动物增强子体外验证载体,从而建立有效的增强子捕获技术体系,为研究增强子调控特性提供参考方法。主要研究结果如下:1.为了获得用于增强子捕获和验证的高效基础启动子,将四个弱启动子(minimal promotor,Myc、Oct4、Krt4和Gata)驱动报告基因mCherry的表达框分别插入Tol2转座元件,构建成增强子捕获载体,与Tol2转座酶mRNA共注射斑马鱼胚胎,结果表明Krt4和Gata的增强子捕获效率高于Myc和Oct4。在此基础上,将鸡HS4隔离子(insulator)克隆至Krt4和Gata增强子捕获框两侧,构建成增强子验证载体,与Tol2转座酶mRNA共注射斑马鱼胚胎,结果表明在72 hpf胚胎产生背景荧光的阳性率,Krt4(约67%,n=302)远高于Gata(约5%,n=301)。以上数据表明,Gata启动子具有较高的增强子捕获效率及最低的背景荧光强度,可用于增强子捕获和检测研究。2.为了比较基础启动子对增强子表达调控水平的影响,在上述Tol2转座子介导的Gata增强子验证载体基础上,用beta-globin弱启动子驱动报告基因GFP构建成另一增强子验证载体。将四个保守性不同的增强子(Z48,hand2,hs769和CNS1)分别克隆至这两个验证载体启动子上游,通过斑马鱼胚胎注射实验,表明Gata能有效验证Z48和CNS1增强子活性及其在胚胎发育过程中的调控模式,beta-globin能有效验证Z48,hand2和CNS1增强子活性及调控模式,提示增强子与不同启动子之间存在互作效应差异性。对增强子调控特性的验证,需要使用多种弱启动子。3.为了建立哺乳动物增强子捕获和验证方法,通过常规分子生物学实验方法,将人源hs278增强子分别与基础启动子Myc、Oct4、beta-globin和TATA连接,克隆至荧光素酶报告基因表达载体pGL3-basic,构建成增强子验证载体,转染MEF、C2C12和3T3 L1等细胞系。结果表明,在MEF细胞中,hs278增强了 Oct4和TATA启动子表达;在C2C12细胞中,hs278增强了 Myc、Oct4和TATA启动子表达活性;而在3T3 L1细胞中,hs278增强了 Myc、Oct4和beta-globin启动子表达活性。结果提示,本研究成功建立了哺乳动物增强子的体外验证方法;hs278增强子表达调控水平存在显著的启动子差异性,对同一启动子调控水平存在细胞差异性。本研究结果进一步验证了增强子具有组织细胞特异性。4.为了进一步提高增强子捕获及注释效率,构建了斑马鱼和小鼠双向增强子捕获载体。以PS转座子为载体框架,插入Gata-m Cherry和Gata-GFP两套增强子捕获框,中间插入HS4隔离子隔开,可以单独捕获插入位点上游和下游的增强子。然后将剪接受体(SA)和多聚腺苷酸(polyA)以不同方向连接至增强子捕获框上游和下游。将此载体与PS转座酶mRNA共注射斑马鱼胚胎,结果表明,在12 hpf、24 hpf和72 hpf三个发育阶段,胚胎mCherry阳性率为0,而GFP阳性率分别为30.2%,61.4%和36.2%。结果提示,该双向增强子捕获载体具有较高的增强子捕获效率,且反方向插入的SA-polyA元件有利于捕获框发挥作用。综上所述,本研究较为系统地完善了增强子捕获和验证技术体系,组合运用转座子、隔离子、剪接受体及poly(A)等顺式作用元件成功构建了高效增强子捕获载体及增强子验证载体。建立了体内和体外增强子活性检测方法,揭示了增强子与不同启动子存在互作效应差异性,验证了增强子具有基因表达调控组织特异性,为进一步研究增强子的调控机制奠定基础。