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前期研究报道高能量日粮促进瘤胃上皮生长可能与血浆IGF-1浓度升高、瘤胃上皮IGF1型受体数量增加有关,但机理不清楚。本文从整体动物、瘤胃器官和组织以及细胞、分子等不同层次系统研究了日粮能量水平对山羊瘤胃上皮生长的影响,并研究了高能量日粮通过IGF系统促进瘤胃上皮生长的细胞和分子生物学机理。1日粮能量水平对山羊瘤胃上皮生长的影响选取18只青年波杂山羊(波尔山羊×淮南羊杂交山羊,120d, BW14.27±0.69kg)随机分成高能量组(HL, n=9, ME:1.00MJ/(kg0.75·d))和低能量组(LL, n=9, ME:0.60MJ/(kg0.75·d)),饲喂42d后处死山羊,采集瘤胃上皮样品。游标卡尺测量、计算瘤胃乳头表面积；组织切片法观察瘤胃上皮组织形态；生化分析技术测定上皮蛋白、DNA和RNA含量；流式细胞术测定细胞周期；Real-time Q-PCR法测定瘤胃上皮cyclin D1、 CDK4、IGF-1R、IGFBP-3mRNA表达；Western Blot方法测定cyclin D1、CDK4蛋白表达。结果显示：1)与LL组相比,HL组山羊日增重、瘤胃干重、瘤胃上皮乳头长度和表面积显著增大(P<0.05),表明高能量日粮显著促进瘤胃上皮乳头生长。2)组织切片和蛋白：DNA比率的测定观察到HL组棘突层和颗粒层细胞层数增多(P<0.05),体积减小(P<0.05),提示高能量日粮促进瘤胃乳头生长主要通过加速细胞增殖,而非细胞肥大。3)流式细胞术分析表明HL组G1期(DNA合成前期)细胞比率降低(P<0.05),而S期(DNA合成期)和G2/M期(有丝分裂期)细胞比率升高(P<0.05),其结果可能加速细胞周期G1期进程,推动细胞从G1期进入S期和G2/M期,进而促进瘤胃上皮细胞增殖。4)HL组瘤胃上皮G1期细胞周期蛋白cyclin D1的mRNA表达提高32%(P<0.05),蛋白质表达增加48%(P<0.05),其激酶CDK4的蛋白表达增加18%(P<0.05),提示高能量日粮条件下山羊瘤胃上皮细胞细胞周期G1期进程加快与G1期细胞周期蛋白cyclin D1和其激酶CDK4表达升高有关。以上体内研究表明高能量日粮提高山羊瘤胃上皮cyclin D1蛋白表达,加速细胞周期G1期进程,促进细胞增殖,加快瘤胃乳头生长。2日粮能量水平影响山羊瘤胃上皮生长的机理研究采用了体内研究和体外研究的方法研究日粮能量水平影响山羊瘤胃上皮生长的机理。动物试验及样品采集方法同系列一,实验前、实验第14d、第35d分别于第一次采食前1h颈静脉采血。放射性免疫分析法测定血清IGF-1浓度；Western blot方法测定瘤胃上皮ERK、pERK、AKT和pAKT蛋白表达,得到日粮能量水平对IGF-1受体后信号转导途径的影响。体内试验研究结果显示：1)HL组山羊血清IGF-1浓度在所测各时间点均高于LL组(P<0.05),提示高能量促进瘤胃上皮乳头生长可能和血清IGF-1升高有关。2)HL组山羊瘤胃上皮pERK/ERK比率显著高于LL组(P<0.05),提示高能量日粮促进山羊瘤胃上皮ERK信号转导途径活化；体内试验申未能检测到pAKT蛋白表达。体外试验选取4只健康青年波杂交山羊,屠宰采集瘤胃上皮样品,胰蛋白酶消化获得单个瘤胃细胞后进行原代培养,24h细胞附着后,分别加入IGF-1、专一性IGF-1R抑制剂(PPP)、ERK抑制剂、AKT抑制剂处理,继续培养8h或24h后收集细胞检测。3H-TdR掺入法测定细胞DNA合成,Real-time Q-PCR法测定cyclin D1和CDK4mRNA表达；Western blot方法测定cyclin D1、CDK4、ERK、pERK、AKT和pAKT蛋白表达。体外试验研究结果显示：3) IGF-1(25μg/L)显著提高体外培养瘤胃上皮细胞3H-TdR掺入率,较对照组提高44%(P<0.05),IGF-1+IGF-1R抑制剂(PPP)组较IGF-1组降低了30%(P<0.05),提示IGF-1必须与IGF-1R才能促进瘤胃上皮细胞增殖。4)IGF-1显著促进体外培养瘤胃上皮细胞G1期cyclin D1mRNA(P<0.05)和蛋白(P<0.05)表达,而对其激酶CDK4mRNA和蛋白表达无显著影响,且IGF-1R抑制剂抑制IGF-1对cylinD1蛋白表达的促进作用(P<0.05)。提示IGF通过提高cyclin D1表达,增加G1期cyclin D1-CDK4复合物合成。5)IGF-1显著增大瘤胃上皮细胞pERK/ERK匕率(P<0.05)；且ERK抑制剂显著抑制IGF-1对瘤胃上皮细胞cyclin D1蛋白表达的促进作用(P<0.05)；而体外IGF-1(P>0.05)和ERK抑制剂(P>0.05)对细胞CDK4蛋白表达均无显著影响。6)体外试验中亦未能检测到pAKT蛋白表达,而AKT抑制剂显著抑制IGF-1对瘤胃上皮细胞cyclin D1蛋白表达的促进作用(0,0.05),提示PI3K/AKT信号转导途径可能在体外试验中起作用,其机制目前尚不明了。对体内、外试验结果的综合分析可以看出：高能量日粮通过提高山羊IGF-1血清浓度促进瘤胃上皮cyclin D1蛋白合成并增加cyclin D1-CDK4复合物,从而加速细胞周期G1期进程,进而促进瘤胃上皮乳头增殖。高能量日粮引起山羊血浆IGF-1浓度升高后,IGF-1通过受体后Ras/Raf/MEK/ERK信号转导途径山羊提高瘤胃上皮G1期周期蛋白cyclin D1表达,促进细胞增殖。本研究结果表明,高能量日粮条件下山羊血清IGF-1浓度升高,IGF-1与瘤胃上皮IGF1型受体结合后激活Ras/Raf/MEK/ERK信号转导途径,提高瘤胃上皮细胞周期G1期周期蛋白cyclin D1的表达,加速细胞周期运转,促进瘤胃乳头生长。