细胞色素P450(CYP)4家族是含血红蛋白的一类多基因超家族酶系,存在于人体内的亚型主要有CYP4A和CYP4Z1等,参与内源物(饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸等)代谢,从而在人肿瘤和多种代谢性疾病的发生发展过程中起重要作用。因此,研究疾病状态下CYP4A和CYP4Z1的表达和功能不仅有利于阐明疾病的发病机理,而且有利于发现新的治疗靶点和候选药物,因而具有重要的理论意义和实用价值。乳腺癌是一种激素依赖性疾病,其死亡率稳居全世界女性恶性肿瘤的首位。目前内分泌治疗是其重要的治疗手段之一。孕激素由于具有抗雌激素和抗增殖效应,且对子宫内膜具有保护作用,故临床上广泛用于乳腺癌的治疗。然而,近年来研究表明,孕酮可促进乳腺癌细胞侵袭,但其机制尚不十分清楚。文献报道,CYP4Z1在乳腺癌组织中过表达,且与乳腺癌的临床病理分级和不良预后高度相关。因为CYP4Z1主要参与脂肪酸(月桂酸、肉豆蔻酸和花生四烯酸)代谢,而且乳腺癌是与膳食脂肪关系极为密切的一类肿瘤,所以研究孕酮对乳腺癌进展的影响及其与CYP4Z1介导的脂肪酸代谢的关系显得尤为重要。已知酗酒和药物性肝损害逐渐成为八十年代以后我国脂肪肝患者的重要病因之一。研究已表明,酒精性肝脂肪变性的发病机制主要与乙醇导致的脂质分解代谢通路受抑和合成代谢通路增强有关。过氧化物酶体增殖子活化受体α(PPARa)调控CYP4A表达,从而在肝脏脂质分解代谢过程中发挥重要作用。葛花是我国的传统中药,广泛用于治疗宿醉和脂肪肝,但其有效成分不明,作用机制不清。因此,本文研究葛花中的有效单体-鸢尾苷对酒精性肝脂肪变性是否具有保护作用,并探讨其作用机制是否与PPARa介导的CYP4A表达有关。本文主要分为以下两个部分：第一部分：CYP4Z1在孕酮促乳腺癌细胞侵袭中的作用及药物干预研究目的：研究孕酮对乳腺癌细胞侵袭的影响,并探讨其作用机制是否与CYP4Z1介导的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸代谢有关。方法：①孕酮或/和米非司酮(RU486,孕酮受体拮抗剂)处理乳腺癌T47D和BT-474细胞,同时采用Transwell侵袭实验观察孕酮对乳腺癌细胞侵袭的影响,采用Western blot技术检测孕酮对乳腺癌细胞CYP4Z1表达的影响；②采用CYP4Z1质粒转染乳腺癌T47D细胞构建CYP4Z1过表达系统(T47D-CYP4Z1),随后观察CYP4特异性抑制剂(HET0016)对CYP4Z1过表达诱导的乳腺癌细胞侵袭的影响；③采用孕酮或/和HET0016、CYP4Z1siRNA处理T47D和BT-474细胞,研究CYP4Z1在孕酮诱导的乳腺癌细胞侵袭中的作用；④孕酮或/和HET0016及CYP4Z1siRNA处理乳腺癌T47D细胞,采用气相色谱质谱法检测CYP4Z1过表达对饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸代谢产物(月桂酸、肉豆蔻酸和20-HETE等)造成的影响；⑤采用孕酮或/和N-豆蔻酰转移酶(NMT)的抑制剂(NIP71)处理乳腺癌T47D和BT-474细胞,观察乳腺癌细胞侵袭的变化；NIP71处理T47D-CYP4Z1细胞观察乳腺癌细胞侵袭的影响；⑥首先采用孕酮或/和米非司酮、HET0016、CPY4Z1siRNA处理T47D和BT-474细胞,检测NMT活性；随后采用CYP4Z1转染T47D细胞,检测CYP4Z1过表达对NMT活性的影响；⑦为进一步观察NMT在CYP4Z1过表达诱导的细胞侵袭中的作用,采用孕酮或/和CPY4Z1siRNA处理T47D和BT-474细胞,通过(?)Western blot技术检测NMT的蛋白表达；⑧孕酮或/和HET0016、NIP71以及CYP4Z1siRNA处理T47D细胞,采用Western blot技术检测基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)、TIMP-2、c-src和磷酸化c-src的蛋白表达水平。结果：孕酮浓度(0～100nM)依赖性诱导乳腺癌T47D和BT-474细胞侵袭(最高可达3倍)；孕酮浓度依赖性增加乳腺癌T47D和BT-474细胞CYP4Z1蛋白表达(最高可达7倍)；CYP4Z1转染可诱导乳腺癌T47D细胞侵袭,而RU486(10μM)、 HET0016(100nM)、NIP71(30nM)和CYP4Z1siRNA处理可抑制孕酮和CYP4Z1过表达诱导的细胞侵袭：与孕酮处理组相比,CYP4Z1siRNA或HET0016(100nM)处理组细胞内月桂酸和肉豆蔻酸含量显著增多,而20-HETE含量明显减少；孕酮(100nM)可上调乳腺癌T47D和BT-474细胞磷酸化c-src表达水平,下调TIMP-2表达水平,且这种作用可被HET0016(100nM)和NIP71(30nM)逆转。结论：孕酮促乳腺癌细胞侵袭,其机制与通过增加CYP4Z1表达,降低细胞中月桂酸和肉豆蔻酸含量,从而激活NMT1,活化c-src并下调TIMP-2有关。以上结果表明,CYP4Z1及其脂质代谢通路可能是阻断人乳腺癌侵袭的新靶标,CYP4Z1及其脂质代谢的抑制剂可成为阻断人乳腺癌侵袭的候选药物。第二部分：CYP4A在鸢尾苷治疗酒精性肝脂肪变性中的作用研究目的：研究葛花中的一种有效单体—鸢尾苷是否对乙醇诱导的肝脂肪变性具有保护作用,并探讨其作用机制是否与CYP4A介导的脂质分解代谢有关。方法：采用乙醇(5g/kg)给小鼠灌胃,间隔12h一次,共3次,制备小鼠酒精性肝脂肪变性模型。小鼠随机分为六组：正常对照组；给药对照组；模型对照组；鸢尾苷低、中、高剂量给药组。鸢尾苷三剂量给药组是在最后一次乙醇灌胃1h后分别给药鸢尾苷(25,50,100mg/kg,i.g.),连续3天内共5次。末次给药4h后处死小鼠,取血清和肝组织备用。具体检测指标及方法如下：①采用酶学分析检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和甘油三酯(TG)水平；②采用常规病理学方法和油红O染色观察酒精性肝脂肪变性程度；③采用实时定量多聚酶链反应(qPCR)检测固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-lc)、PPARa和它们的靶基因包括CYP4A、中链酰基CoA脱氢酶(MCAD)和酰基CoA氧化酶(ACO)等的表达水平；④采用酶学分析测定肝微粒体CYP4A活性,肝线粒体ACD活性,肝过氧化物酶体ACO活性；⑤测定线粒体渗透性转换(MPT)和膜电位(△Ψm)。结果：小鼠急性乙醇暴露可使外周血ALT、AST和TG水平显著升高,肝组织中TG水平升高,MPT增加,△Ψm降低。然而,鸢尾苷可剂量(25,50,100mg/kg)依赖性逆转乙醇对上述指标的影响。鸢尾苷还可显著降低乙醇暴露导致的脂质过氧化物产生。鸢尾苷可逆转乙醇导致的PPARα和它的靶基因(CYP4A、 MCAD和ACO) mRNA表达和酶活性水平的下调,但对乙醇诱导的SREBP-lc及其靶基因mRNA表达上调无明显影响。结论：葛花中的有效单体鸢尾苷对乙醇诱导的肝脂肪变性具有保护作用,其机制与改善乙醇导致的脂质分解代谢(PPARα通路及其下游靶基因CYP4A等)和线粒体功能有关。以上结果表明,PPARα及其下游靶基因CYP4A可能是治疗酒精性肝脂肪变性的新靶标,而鸢尾苷可成为治疗酒精性肝脂肪变性的候选药物。