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昆虫BR-C(Broad Complex)是Ecd受体激活的早期转录因子之一,参与昆虫细胞凋亡和成虫组织建成的作用,BR-C-选择性剪切表达出4种含Z1~Z4锌指外显子的剪切体蛋白。在家蚕(Bombyx mori)已克隆鉴定到BmBR-C的3个剪切体BmBR-C-Z1、Z2、Z4。通过Northern Blot杂交和RT-PCR扩增的检测初步显示,这3种剪切体在家蚕发育不同时期的组织中呈现差异表达活性,除了BmBR-C-Z2在翅原基的蛋白表达外,目前还缺乏在其它组织的蛋白表达检测。
为此,本文的研究目的和内容为:(1)表达和纯化BmBR-C-Z4剪切体全长蛋白,制作抗血清,用于今后免疫组化和免疫电镜技术研究家蚕细胞凋亡和自噬机制;(2)通过Western Blot杂交,检测BmBR-Cs剪切体在家蚕五龄幼虫一蛹变态期的中肠、丝腺、脂肪体和表皮中的表达,完善其蛋白水平的检测数据,为今后研究BmBR-C基因的功能提供参考。
本文初步获得以下结果:
1.通过对pET-21d-BmBR-C-Z4表达质粒在Ecoli BL21(DE3)宿主菌中的诱导表达,获得包涵体表达的BmBR-C-Z4蛋白,经尿素裂解变性和Ni柱层析分离,目的蛋白纯度为94.55%。通过12% SDS-PAGE电泳再次切割回收目的蛋白胶块,用氮研磨后按体积比1:1与弗氏佐剂混合,免疫新西兰大白兔,获得抗血清,其效价达到1:40000。
2.Western Blot杂交检测结果显示BmBR-Cs剪切体在家蚕不同发育时期丝腺、中肠、表皮和脂肪体中的表达呈现差异:(1)在5龄幼虫~化蛹2d的丝腺,化蛹前表达微弱不稳定,预蛹期(吐丝3d末)较强,在化蛹ld很强,化蛹2d略有降低:(2)在5龄ld幼虫~化蛹8d的中肠均有强的表达,但化蛹前的表达水平显著低于化蛹期的表达水平;(3)在5龄幼虫~化蛹2d的表皮,熟蚕(5龄8d)~化蛹2d呈现较弱的差异表达,其中预蛹(吐丝3d末)的表达信号相对较强;(4)在5龄期幼虫~化蛹8d的脂肪体,均显示很强的表达信号;(5)在丝腺、中肠和表皮检测到一条约25~30 kDa的未知蛋白带。
3.本文进行的蛋白水平检测结果与文献报道的RNA水平检测结果基本吻合,提示BmBR-Cs剪切体的表达特征可能为:(1)在5龄幼虫~化蛹2d的丝腺均有表达,化蛹前达到高峰,直到化蛹3d丝腺降解消亡;(2)在5龄幼虫~化蛹8d的中肠组织均有较强的表达,化蛹后表达显著增高并一直持续高表达活性到蛹期末;(3)在幼虫期表皮的弱表达可能与幼虫蜕皮活动相关联,而在预蛹期的高表达则可能与蛹蜕皮活动有关;(4)在幼虫~蛹变态期的脂肪体中呈持续较高活性的表达可能与脂肪体的分化发育特征相关。