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目的血吸虫病是一种呈全球分布的、危害严重的人兽共患寄生虫病。流行于中国的主要为日本血吸虫病,在我国其仍然是一个值得重视的严重的公共卫生问题。我国现有的吡喹酮化疗、灭螺等血防措施虽然对血吸虫病的防治起到重要作用,但尚不能达到完全控制甚至消除血吸虫病的目的,而血吸虫病疫苗的研究为此带来了希望。由于各种不足,目前为止尚没有一种安全、有效的血吸虫疫苗应用于临床。本研究拟利用日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)14-3-3和Sj32抗原编码基因,以两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum,Bb)为“载体”,构建日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj14-3-3-Sj32)疫苗,并研究Sj14-3-3-Sj32融合基因在两歧双歧杆菌中的表达情况,为日本血吸虫病疫苗的研究奠定基础。方法1.以本室保存的质粒pGEX-Sj14-3-3和p ET28α-Sj32为模板,通过PCR扩增出Sj14-3-3和Sj32抗原编码基因,再将得到的两个目的基因用基因拼接技术(gene SOEing)进行剪接,得到Sj14-3-3-Sj32融合基因;再将穿梭表达载体pGEX-1λT与构建的融合基因拼接,得到重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32;采用电穿孔法将pGEX-Sj14-3-3-Sj32转化至大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)中,再用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)对其进行诱导表达;最后采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达产物,用蛋白印迹(Western blot)技术对表达蛋白的免疫原性进行分析。2.培养Bb菌,将构建的重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32电转化至B b菌中,构建重组Bb(pGEX-Sj14-3-3-Sj32)疫苗;用IPTG对疫苗进行诱导表达,再通过SDS-PAGE鉴定表达产物,以及Western blot技术分析表达蛋白的免疫原性。结果1.采用基因拼接技术成功得到长度约为1 750 bp的Sj14-3-3-Sj32融合基因;重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32经双酶切证实构建成功;SDS-PAGE分析结果显示重组质粒经IPTG诱导表达的产物为Mr约73k Da的重组蛋白;Western blot显示表达的重组蛋白可被Sj感染的兔血清所识别。2.双酶切和PCR均证实重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32成功转入Bb菌中,r Bb(pGEX-Sj14-3-3-Sj32)疫苗构建成功;SDS-PAGE分析显示,重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32经IPTG诱导后可在Bb菌中表达Mr约73KDa的重组蛋白,与预期结果相符,且在诱导后的2~3d表达水平较高,表达的蛋白占菌体总蛋白的8.2%;Western blot结果显示Sj感染的兔血清可识别所表达的重组蛋白。结论1.成功合成融合基因Sj14-3-3-Sj32,并与穿梭表达载体连接后得到重组质粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32;2.重组质粒在大肠埃希菌中能表达Mr约为73 k Da的重组蛋白,且具有较强的免疫原性;3.日本血吸虫r Bb(pGEX-Sj14-3-3-Sj32)疫苗经证实构建成功,且该疫苗可表达具有抗原特异性的Sj14-3-3-Sj32重组蛋白。