论文部分内容阅读
羧酸酯酶是昆虫的三大解毒酶之一,在昆虫抗药性的产生和发展方面发挥重要的作用。而黏虫Mythimna separata是农业生产中重要的农业害虫,一旦大发生,会造成严重的经济损失。本研究在黏虫转录组库中筛选出12条羧酸酯酶基因序列,对基因序列进行了验证。通过杀虫剂处理,荧光定量检测筛选出表达量显著提高的基因进行下一步的详细研究。对筛选出的基因进行时空表达和药剂影响研究。然后使用RNA干扰,对筛选出基因的功能进行分析,检测干扰不同时间的基因沉默效率,并测量干扰后黏虫体内羧酸酯酶的总活性变化以及干扰后杀虫剂对黏虫的杀虫活性。得到的研究成果如下:（1）本研究获得12条羧酸酯酶基因c DNA全长序列。它们均具有羧酸酯酶基因的两个保守结构域:羧酸酯酶丝氨酸活性中心F/Y-G-G-D/N-x（3）-V/I-T/V-L/I/V-x-G-x-S-A/G-G;二硫键形成的活性位点E-D-C-L-x-A/L/I/V-N-V/I-Y-x-P。在NCBI上进行登录,分别命名为Ms Car E1-12,取得的登录号分别为MK440541-MK440552。它们的长度分别为1623、2683、1865、1811、2200、2281、2299、1851、1882、1961、1782和1824 bp,分别包含长度为1365、2250、1740、1665、1644、1767、1665、1608、1665、1623、1665和1689 bp的开放阅读框。编码454、749、579、554、547、588、554、535、554、540、554和562个氨基酸。氨基酸的等电点分别为5.41、4.72、6.24、4.95、4.70、6.06、5.69、5.73、5.22、7.96、5.13和5.15,分子量分别为51.196、83.919、65.435、62.918、61.713、63.241、62.113、59.816、62.706、60.417、61.603和62.837 k Da。（2）两种杀虫剂LD50剂量处理后,各个基因的表达存在显著差异。使用LD50的20%氯虫苯甲酰胺诱导后,Ms Car E1、Ms Car E3、Ms Car E4、Ms Car E7、Ms Car E8和Ms Car E12六条基因的表达量显著上调,其中Ms Car E3和Ms Car E4表达量上调最显著。使用LD50的5%高效氯氟氰菊酯处理后,Ms Car E5、Ms Car E8和Ms Car E10三条基因的表达量显著上调,而Ms Car E5和Ms Car E10的表达量上调最显著。综上结果,筛选出Ms Car E3、Ms Car E4、Ms Car E5和Ms Car E10四条基因进行后续研究。（3）Ms Car E3、Ms Car E4、Ms Car E5和Ms Car E10四条基因在不同的发育阶段和不同组织均有表达,但表达量存在显著差异。Ms Car E3在成虫期表达量高于幼虫期和蛹期,幼虫期在3龄的表达量最高,5龄幼虫中的表达量最低。Ms Car E4从1龄到4龄表达量呈现逐渐上升的趋势,在4龄的表达量最高,约为1龄表达量的78.2倍,4龄表达量与6龄表达量没有差异显著性,在成虫阶段的表达量最低。Ms Car E5在预蛹期的表达量最低,但与成虫阶段和蛹期的表达量没有显著性差异,在5龄的表达量相对最高。Ms Car E10在5龄的表达量最高,在预蛹期的表达量相对最低。Ms Car E3在体壁中表达量最高,在后肠的表达量最低。Ms Car E4在唾腺中表达量最高,与体壁中的表达量不存在差异显著性,在中肠中表达量相对最低。Ms Car E5在唾腺中的表达量相对最低,在中肠表达量最高,为唾腺表达量的223.0倍。Ms Car E10在体壁中的表达量最高,是表达量最低的唾腺中的75.8倍,与前肠表达量没有差异显著性。（4）不同剂量的杀虫剂处理4龄第一天幼虫不同时间,Ms Car Es基因表达量存在显著性差异。20%氯虫苯甲酰胺LD10诱导,Ms Car E3基因处理48 h开始诱导,而Ms Car E4基因则在处理24 h就开始诱导,并且诱导效果持续到48 h。LD30处理,Ms Car E3基因表达量先不变后诱导,处理24-48 h有诱导作用,Ms Car E4基因只在24 h时表达量被诱导。LD50剂量处理与LD30处理相同,Ms Car E3基因表达量在24-48 h表达受诱导,Ms Car E4只有处理24 h诱导。LD70处理,Ms Car E3基因表达量先不变后诱导,处理6 h开始诱导,诱导效果持续到48 h,而Ms Car E4基因的表达一直被抑制。结果显示,Ms Car E3基因受剂量高杀虫剂处理的诱导作用更明显,而对于Ms Car E4基因则是低剂量杀虫剂诱导更强。5%高效氯氟氰菊酯LD10处理,Ms Car E5基因表达量处理24 h开始诱导,诱导作用持续到48 h,而Ms Car E10基因表达量只有处理24 h被诱导。LD30处理,Ms Car E5基因表达量先不变后诱导,处理24和48 h有诱导作用,Ms Car E10基因与LD10处理时情况相同,只有处理24 h表达量被诱导。LD50处理,Ms Car E5和Ms Car E10基因表达情况与LD30剂量处理情况相同。LD70处理,Ms Car E5基因表达量一直被抑制,而Ms Car E10基因表达量先被诱导后不变,3-12 h表达量被诱导。结果显示低剂量对Ms Car E5基因的诱导作用更强,而Ms Car E10基因则是高剂量对其诱导作用更强。（5）RNA干扰成功抑制了Ms Car Es的表达。单条基因干扰时,处理组Ms Car E3基因表达量在注射12 h和24 h后显著被抑制,12 h的抑制效果最好,抑制率达到82.8%。Ms Car E4基因的表达量在注射后3 h和6 h显著被抑制,注射后6 h抑制率最高,为90.2%。Ms Car E5表达量注射后48 h内均呈抑制趋势,但注射后3 h,抑制效果最好。Ms Car E10的表达量在注射后6 h和12 h被抑制,干扰6 h抑制率最高。而混合干扰时,发现Ms Car E3只在干扰后3 h表达量被抑制,抑制率为50.0%。Ms Car E4基因表达量在注射后12 h内均被抑制,但在注射后3 h抑制效果最好。Ms Car E5基因在注射后12 h内表达量均被抑制,与单基因干扰情况相同,3 h干扰效果最好。Ms Car E10在注射6 h后被抑制。（6）RNA干扰Ms Car E5后,高效氯氟氰菊酯对黏虫的杀虫活性显著提高约25-30%。注射si RNA3、si RNA4及两者混合物的幼虫,羧酸酯酶活性未降低反而有升高的现象。而用LD50的氯虫苯甲酰胺处理RNA干扰后的幼虫,发现注射si RNA3及si RNA4幼虫与对照相比死亡率降低,而注射两者混合物的幼虫在处理24 h后的死亡率也低于对照组。注射si RNA5和si RNA5、si RNA10混合物的幼虫在处理3-12 h后体内的羧酸酯酶的活性显著降低,而注射si RNA10的幼虫只有在注射12 h时羧酸酯酶的活性显著降低。用LD50的高效氯氟氰菊酯处理RNA干扰后的幼虫发现,注射si RNA5及两者混合物的幼虫死亡率显著上升,并且在处理后24 h,混合干扰效果更好,死亡率提高约30%。本试验为深入了解黏虫羧酸酯酶提供理论依据,为分析羧酸酯酶功能和了解黏虫抗药性机制奠定了基础。