论文部分内容阅读
哺乳动物红系细胞在发育分化过程中,其细胞形态变化和基因表达产物呈一定的规律性。从原幼红细胞分化为红细胞,细胞体积及细胞核逐渐缩小,最后核固缩被排出形成成熟的红细胞。当红系细胞发生癌变时,会停滞在分化的某个阶段,细胞异常增殖,其血红蛋白表达处于关闭状态,形成红白血病细胞。早期曾认为,正常细胞一旦异常增殖形成肿瘤细胞是不可逆的。越来越多的研究发现,在某些诱导剂的作用下恶性肿瘤细胞可以向正常细胞分化,这种现象称为肿瘤细胞的诱导分化。如二甲基亚砜(DMSO)、六甲基烯二乙酰胺(HMBA)和丁酸钠(NaBu)等诱导剂诱导MEL细胞后,可使其重新进入分化阶段,开始表达血红蛋白,这是红白血病细胞独有的特征,也是研究细胞分化与癌变的良好模型。小鼠经尾静脉注射致贫血病毒FVA后,脾脏中的红系细胞同步停滞在原幼红细胞时期,在体外促红细胞生成素EPO作用下进入终末分化过程,FVA细胞保留了CFU-E红系细胞的分化特征,与正常红系细胞分化过程类似,所以大多以此模型研究红系细胞分化过程及白血病的发病机制。为深入研究细胞分化与癌变的机制,本文在建立DMSO诱导MEL细胞分化和FVA细胞分化模型基础上,进行了3方面研究：1. FVA细胞分化过程中细胞形态学动态变化研究本文利用FVA病毒诱发脾脏使细胞同步化在原幼红细胞,通过形态学染色观察、实时监控培养、扫描电镜和免疫荧光结合激光共聚焦显微镜(LSCM)等技术对FVA细胞在EPO存在的条件下,分别培养Oh、2h、12h、24h、36h、48h、60h、72h的细胞形态、细胞排核的过程、血岛的形成和巨噬细胞吞噬细胞核的过程进行时序性观测；对红系细胞表面标志蛋白CD71和Ter119,红系骨架相关蛋白Stathmin、Septin8和RBBP4进行了定量分析；实验发现在体外培养过程中,FVA细胞体积大小出现规律性变化,细胞逐渐变小。实时监控培养观察细胞排核过程时发现：从核固缩(中幼红细胞)到核排出大约需要7-8h。扫描电镜观察到,刚排出核的网织红细胞呈多种形态,排出的核被巨噬细胞所吞噬。在红系细胞分化过程中,CD71和Ter119表达量均高于非红系细胞,而与骨架相关的蛋白Stathmin, Septin8和RBBP4在分化过程中含量逐渐减少。2.FVA细胞及DMSO诱导MEL细胞分化过程差异蛋白质组学研究1)FVA细胞分化过程差异蛋白质组研究：对体外EPO诱导培养Oh、2h、12h、24h、36h、48h、60h和72h的FVA细胞双向电泳和质谱分析,共鉴定出117种差异蛋白质或蛋白质亚基,按功能可分为12类,比例最大的前3类分别是：酶类蛋白占32%；结构蛋白占13%；调节蛋白占10%。2)利用DMSO诱导MEL细胞,通过联苯胺染色、MTT比色法和Ter119免疫荧光等实验检测细胞的分化和活力情况,并利用双向电泳偶联质谱技术,结合生物信息学分析诱导MEL细胞分化过程中差异表达的蛋白质。MTT实验显示,1.0%、1.2%、1.4%的DMSO对MEL细胞的活力没有明显的抑制作用,1.2%的DMSO作用MEL细胞120h后,细胞诱导分化率达到67%。对体外DMSO诱导培养Oh、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h的MEL细胞双向电泳和质谱分析,共鉴定出87种差异蛋白质或蛋白质亚基,按功能可分为12类,比例最大的前3类分别是；41%酶类蛋白；15%结构蛋白；13%调节蛋白。共有28种蛋白同时存在于DMSO诱导MEL细胞和FVA细胞的差异蛋白质中,按功能可分为8类,表明这些蛋白在分化过程中起到重要作用。3.Stathmin在分化中的功能的初步研究FVA细胞分化过程中出现核固缩,排核并呈现明显的细胞骨架变化,而Stathmin是隶属于调控微管细胞骨架的蛋白家族,通过促进微管解聚作用和阻止微管蛋白异二聚体聚合作用来调节微管动力学,同时Stathmin是肿瘤标志性蛋白,Western blot结果表明在分化的MEL细胞中呈低表达。所以从FVA细胞差异蛋白中选出与细胞骨架相关蛋白质Stathmin进行RNA干扰的功能学研究。构建Stathmin干扰载体,包装病毒后侵染MEL细胞,利用嘌呤霉素(puromycin)筛选稳定株。MTT实验显示,Stathmin低表达后能提升MEL细胞的生长活力。这些数据为进一步研究Stathmin在红系分化过程中及肿瘤细胞的逆转中的功能,解析细胞分化能和肿瘤细胞逆转机制奠定实验基础。