第一部分p-防御素-2在小鼠胃黏膜中的表达[目的]mBD-2是防御素家族中的重要成员,其主要在消化道、呼吸道和生殖道的上皮细胞中表达。本研究的目的旨在通过小鼠体内实验观察mBD-2在小鼠胃黏膜中的表达情况。[方法]1.免疫组织化学方法：通过体内实验,观察小鼠胃黏膜中mBD-2的表达情况。取小鼠的胃黏膜,按照免疫组化的操作步骤依次将胃黏膜固定、包埋、切片、加抗及染色,封片后观察mBD-2在小鼠胃黏膜中的表达情况。2.聚合酶链反应：取小鼠胃黏膜,按照PCR反应的操作步骤进行实验,检测mBD-2在小鼠胃黏膜中mRNA水平的表达。3.免疫印迹法：取小鼠胃黏膜,按照Western blot的操作步骤,检测mBD-2在小鼠胃黏膜中蛋白水平的表达情况。[结果]1.mBD-2在小鼠胃黏膜中的表达：经免疫组化检测,可以看到在小鼠胃黏膜上皮细胞的胞浆中有较多的棕色颗粒,表明mBD-2在小鼠胃黏膜中有表达。2.mBD-2在小鼠胃黏膜中mRNA的表达：经定量PCR检测,mBD-2在小鼠胃黏膜中mRNA水平有表达。3.mBD-2在小鼠胃黏膜中蛋白水平的表达：经Western blot检测,mBD-2在小鼠胃黏膜中蛋白水平有表达。[结论]在小鼠体内实验中,我们通过免疫组化、PCR和免疫印迹等方法探讨了小鼠胃黏膜中mBD-2的表达情况,发现mBD-2无论在mRNA水平,还是在蛋白水平在小鼠胃黏膜中均有表达。第二部分mBD-2在小鼠胃黏膜上皮细胞中的表达[目的]由第一部分的小鼠体内实验我们发现mBD-2在小鼠胃黏膜中有表达,为了进一步研究mBD-2表达的机制,我们将进行体外实验,对小鼠胃黏膜上皮细胞中mBD-2的表达情况加以研究,以期为下一步探讨mBD-2的表达机制奠定基础。[方法]1.免疫荧光法：取购置的小鼠胃黏膜上皮细胞,进行细胞培养及传代,按照免疫荧光法的操作步骤实验,观察小鼠胃黏膜上皮细胞中mBD-2的表达情况。2.聚合酶链反应：取购置的小鼠胃黏膜上皮细胞,进行RNA的提取,按照PCR反应的操作步骤进行实验,检测mBD-2在小鼠胃黏膜上皮细胞中mRNA水平的表达。3.免疫印迹法：取购置的小鼠胃黏膜上皮细胞,按照Western blot的操作步骤,检测mBD-2在小鼠胃黏膜中蛋白水平的表达情况。[结果]1.mBD-2在小鼠胃黏膜上皮细胞中的表达：经免疫荧光法检测,可以看到mBD-2在小鼠胃黏膜上皮细胞中有表达,呈现出绿色荧光,而在阴性对照中则没有任何荧光蛋白表达。2.mBD-2在小鼠胃黏膜上皮细胞中mRNA的表达：经PCR检测,mBD-2在小鼠胃黏膜上皮细胞中mRNA水平有表达。3.mBD-2在小鼠胃黏膜上皮细胞中蛋白水平的表达：经Western blot检测,mBD-2在小鼠胃黏膜上皮细胞中蛋白水平有表达。[结论]上述体外实验的研究发现,mBD-2在小鼠胃黏膜上皮细胞中表达,并且无论在mRNA水平,还是在蛋白水平小鼠胃黏膜上皮细胞中均有表达。为我们在体外实验中进一步研究mBD-2的产生机制奠定了基础。第三部分大肠杆菌对小鼠胃黏膜上皮细胞增殖和mBD-2表达的影响[目的]大肠杆菌是引起急性胃炎的重要生物因素之一。本研究在体外用大肠杆菌(肠产毒性大肠杆菌06:K15：H16)作用于小鼠胃黏膜上皮细胞,来观察小鼠胃黏膜上皮细胞的增殖情况,并观察小鼠胃黏膜上皮细胞在面临大肠杆菌侵袭时做出的反应,其自身抗菌肽mBD-2的表达量的变化。为进一步研究mBD-2产生的机制奠定基础。[方法]1.MTT法：用MTT法检测大肠杆菌在体外对小鼠胃黏膜上皮细胞增殖作用的最佳浓度与作用时间。2. TUNEL法：用TUNEL法检测大肠杆菌在体外作用于小鼠胃黏膜上皮细胞后,细胞的凋亡情况。3.PCR：用10个/ml、102个/ml、103个/ml和104个/ml不同浓度的大肠杆菌作用于小鼠胃黏膜上皮细胞,4,8和12h后收集细胞,用定量PCR检测mBD-2在mRNA水平的表达量。4.免疫印迹法：用10个/ml、102个/ml、103个/m1和104个/ml不同浓度的大肠杆菌作用于小鼠胃黏膜上皮细胞,4,8和12h后收集细胞,用Western blot检测mBD-2在蛋白水平的表达量。[结果]1.大肠杆菌对小鼠胃黏膜上皮细胞增殖抑制率与大肠杆菌浓度及作用时间的关系：MTT检测结果显示,用10个/ml、102个/ml、103个/ml和104个/ml不同浓度的大肠杆菌作用于小鼠胃黏膜上皮细胞,在12,24和48h观察结果,均有不同程度的抑制作用,细胞增殖抑制率随大肠杆菌浓度的增加而升高,且浓度相同时,随着时间的延长,对小鼠胃黏膜上皮细胞的增殖抑制率也升高(P<0.05)。2.大肠杆菌对小鼠胃黏膜上皮细胞凋亡的影响：用103个/ml的大肠杆菌作用于小鼠胃黏膜上皮细胞后,于0,24和48h后观察细胞的凋亡情况。可见经大肠杆菌作用的细胞有凋亡存在,且实验组较对照组的绿色荧光数量所占细胞比例多(P<0.05)。3.不同浓度的大肠杆菌对小鼠胃黏膜上皮细胞中mBD-2 mRNA表达的影响：用10个/ml、102个/ml、103个/ml和104个/ml的大肠杆菌作用于小鼠胃黏膜上皮细胞,4,8和12h后收集细胞,提取小鼠胃黏膜上皮细胞的总RNA,做定量PCR,结果显示：在4h时,103个/ml和104个/ml的mBD-2在mRNA水平上的表达量显著高于10个/ml和102个/ml组(P<0.05)；当在8h时,各组的mBD-2在mRNA水平上的表达量均增加,且103个/ml和10个/ml的mBD-2在mRNA水平上的表达量显著高于10个/ml和102个/ml组(P<0.05)；当在12h时,由于细胞已经几乎死亡,此时收集到的细胞较少,然而对于活着的细胞其mBD-2在mRNA水平上的表达量很高,但是在各组之间均没有显著差异(P>0.05)。4.不同浓度的大肠杆菌对小鼠胃黏膜上皮细胞中mBD-2蛋白表达的影响：用10个/ml、102个/ml、103个/ml和104个/ml的大肠杆菌作用于小鼠胃黏膜上皮细胞,4,8和12h后收集细胞,提取小鼠胃黏膜上皮细胞的总蛋白,经Western blot检测,可见蛋白水平的表达情况如下,在4h时,103个/ml和104个/ml的mBD-2在蛋白水平上的表达量显著高于10个/ml和102个/ml组(P<0.05)；当在8h时,各组的mBD-2在蛋白水平上的表达量均增加,且103个/ml和104个/ml的mBD-2在蛋白水平上的表达量显著高于10个/ml和102个/ml组(P<0.05)；当在12h时,由于细胞已经几乎死亡,此时收集到的少量细胞其mBD-2在蛋白水平上的表达量很高但是在各组之间均没有显著差异(P>0.05)。[结论]1.大肠杆菌能够抑制小鼠胃黏膜上皮细胞的增殖,且抑制率与大肠杆菌的浓度及作用时间呈正相关关系。2.大肠杆菌作用于小鼠胃黏膜上皮细胞后,可以导致细胞的凋亡,随着作用时间的延长,细胞凋亡率逐渐增加,不同时间点相比较有显著差异。3.大肠杆菌作用于胃黏膜上皮细胞后,mBD-2的表达量无论在mRNA水平上还是蛋白水平上都较高,且与作用时间及细菌浓度呈正相关关系。4.为下一步我们研究p-防御素-2的产生机制奠定了基础。第四部分大肠杆菌在小鼠胃黏膜上皮细胞中诱导mBD-2表达的MAPK机制[目的]第三部分实验结果初步证实大肠杆菌在小鼠胃黏膜上皮细胞中可以诱导mBD-2的表达,然而在小鼠胃黏膜上皮细胞内mBD-2是如何产生的,其产生的机制如何等尚未见报道。本研究就mBD-2产生的MAPK通路机制做以研究。[方法]用103个/ml的大肠杆菌作用小鼠胃黏膜上皮细胞,分别于作用0,4,8和12h收集细胞,提取蛋白后通过Western Blot法,检测p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、p-Rsk90磷酸化水平及ERK1/2、p38、JNK、Rsk90的表达量。[结果]1.ERK1/2在小鼠胃黏膜上皮细胞中的表达：在浓度为103个/ml的大肠杆菌作用于小鼠胃黏膜上皮细胞后,8和12h时p-ERK1/2的蛋白磷酸化水平较0和4h组显著增高(P<0.05);而在0和4h组p-ERK1/2的蛋白磷酸化水平没有显著差异(P>0.05)；同样是在8和12h组p-ERK1/2的蛋白磷酸化水平没有显著差异(P>0.05)。与此同时,作为ERK1/2的下游蛋白因子Rsk90,同样为8和12h时p-Rsk90的蛋白磷酸化水平较0和4h组显著增高(P<0.05)；而在0和4h组p-Rsk90的蛋白磷酸化水平没有显著差异(P>0.05)；同样是在8h和12h p-Rsk90的蛋白磷酸化水平没有显著差异(P>0.05)。2.JNK在小鼠胃黏膜上皮细胞中的表达：在浓度为103个/ml的大肠杆菌作用于小鼠胃黏膜上皮细胞后,磷酸化的JNK的表达量以及p-JNK的磷酸化水平在各个时间点都很低,无显著差异(P>0.05)。3.p38在小鼠胃黏膜上皮细胞中的表达：在浓度为103个/ml的大肠杆菌作用于小鼠胃黏膜上皮细胞后,磷酸化的p38的表达量以及p-p38的磷酸化水平在各个时间点都很低,无显著差异(P>0.05)。[结论]大肠杆菌作用于小鼠胃黏膜上皮细胞时能激活ERK1/2途径。第五部分ERK抑制后小鼠胃黏膜上皮细胞中mBD-2和MAPK通路其他蛋白表达及细胞的生长情况[目的]第四部分实验中我们已经初步证明大肠杆菌在侵袭小鼠胃黏膜上皮细胞后mBD-2的产生是通过MAPK通路中的ERKl/2途径来实现的。在本部分研究中通过应用RNA干扰技术将ERK1/2抑制后,来检测MAPK其他蛋白因子的磷酸化情况,同时检测mBD-2的表达量和小鼠胃黏膜上皮细胞的生长情况来进一步证明大肠杆菌在侵袭小鼠胃黏膜上皮细胞后mBD-2的产生是通过ERK1/2途径来实现的。[方法]用RNA干扰的方法把小鼠胃黏膜上皮细胞中的ERK沉默,用103个/ml的大肠杆菌对小鼠胃黏膜上皮细胞作用,4,8和12h后收集细胞,提取小鼠胃黏膜上皮细胞的RNA和总蛋白,经定量PCR和Western blot检测mBD-2的表达,同时检测Rsk90, JNK和p38的蛋白磷酸化水平。用MTT法检测细胞12,24和48h的生长情况。[结果]1.质粒转染效率的检测结果：收集培养48h的空白对照、阴性质粒转染、干扰质粒转染的细胞,提取RNA及总蛋白,经PCR和Western blot检测,干扰组没有目的基因及蛋白的表达,而阴性对照组和空白对照组的目的基因及蛋白有表达,且表达量较高,说明ERK1基因的表达有明显的抑制效果。2.ERK被沉默后mBD-2的表达情况：用103个/ml的大肠杆菌对小鼠胃黏膜上皮细胞作用,在0,4,8和12h后收集细胞,提取小鼠胃黏膜上皮细胞的RNA和蛋白,经定量PCR和Western blot检测,可见mBD-2在mRNA和蛋白水平的表达在4,8和12h表达量差异不显著,且表达量均较低(P>0.05)。3.ERK被沉默后MAPK通路中其他蛋白的表达情况：Rsk90, JNK和p38的蛋白磷酸化水平与ERK没有被沉默时一样,在各个时间点都很低,没有显著差异(P>0.05)。4.ERK被沉默后小鼠胃黏膜上皮细胞的生长情况：用MTT法检测细胞12,24和48h的生长,在12和24小时时,干扰组细胞的细胞抑制率明显高于空白组和阴性对照组(P<0.05)。而当到48小时时三组细胞的抑制率一样,此时细胞几乎全部死亡。而对于干扰组来说,其抑制率增加速度明显高于其他两组,在24小时时已经达到97.7%。[结论]ERK被沉默后,mBD-2的表达量降低,使得小鼠胃黏膜上皮细胞在受到大肠杆菌侵袭时,抵抗外源菌的mBD-2减少,因此细胞生长情况更为降低。上述结果进一步表明ERK对小鼠胃黏膜上皮细胞中mBD-2的表达有调控作用。