骨质疏松症已成为世界性公共健康问题，而目前市场上预防和改善骨质疏松的药物存在较大的副作用或者效果不佳，因此研究和开发具有促进骨骼健康、预防和改善骨质疏松的天然活性成分以及功能性食品具有良好的应用前景。γ-生育三烯酚属于异戊二烯植物化合物，诸多动物研究证明γ-生育三烯酚对骨代谢和骨重建有促进作用，然而关于其在细胞水平上的机制尚未阐明。本研究在前期研究工作的基础上，进一步研究γ-生育三烯酚对MC3T3-E1细胞增殖分化的诱导作用，并应用阻断剂分析在骨形成中起核心作用的Wnt/β-catenin信号通路在γ-生育三烯酚促进成骨细胞增殖分化功能中的作用，在细胞和分子水平上较为系统的阐明γ-生育三烯酚成骨活性的作用机理。
　　实验通过倒置显微镜观察MC3T3-E1细胞形态；绘制细胞生长曲线；MTT测定细胞活力；ELISA试剂盒测定碱性磷酸酶(ALP)活性，以及采用茜苏红染色法检测矿化情况。结果发现4-8μmol/L的γ-生育三烯酚能促进MC3T3-E1细胞的增殖，16-32μmol/L的γ-生育三烯酚对MC3T3-E1细胞的增殖具有抑制作用，而2-32μmol/L的α-生育酚对MC3T3-E1细胞无明显的增殖作用。2-16μmol/L的γ-生育三烯酚能增加ALP碱性磷酸酶的活性，其中4μmol/L的γ-生育三烯酚与同浓度的α-生育酚相比诱导细胞分化的效果最显著；4μmol/L的γ-生育三烯酚作用细胞21d后能显著增加MC3T3-E1细胞的矿化能力，而同浓度的α-生育酚对MC3T3-E1细胞的矿化作用不明显，同时研究发现γ-生育三烯酚和β-甘油磷酸钠能协同促进成骨细胞矿化，显著增强细胞的分化能力。
　　采用特异性阻断剂处理后，考察Wnt/β-catenin信号通路与γ-生育三烯酚促进成骨细胞增殖、分化作用的关系。采用MTT检测细胞活力；流式细胞仪检测细胞周期变化；Western-blot检测PCNA、KI67增殖蛋白的表达；ELISA试剂盒测定ALP碱性磷酸酶活性；小鼠分化蛋白检测试剂盒检测相关分化蛋白(OPN、OCN、BPM2、BMP4、ON)的浓度。结果显示，4μmol/L的γ-生育三烯酚以及10mmol/L的LiCl(能激活Wnt/β-catenin信号通路)分别作用MC3T3-E1细胞后G0/G1期减少，S期增加，KI67和PCNA蛋白表达量上调，ALP碱性磷酸酶活性增加，同时与成骨细胞分化相关的蛋白(OPN、OCN、BPM2、BMP4、ON)浓度上调。而XAV-939阻断剂组、XAV-939阻断剂与γ-生育三烯酚联合用药组以及XAV-939阻断剂与LiCl联合用药组作用MC3T3-E1细胞后将MC3T3-E1细胞阻滞在G0/G1期，同时KI67和PCNA蛋白表达量下调，ALP碱性磷酸酶活性减少，OPN、OCN、BPM2、BMP4、ON蛋白浓度减少。该结果提示γ-生育三烯酚可以通过Wnt/β-catenin信号通路发挥促进MC3T3-E1细胞增殖分化的作用。
　　在XAV-939阻断剂的干预下，分析γ-生育三烯酚对Wnt/β-catenin通路的作用靶点。采用Western-blot法检测MC3T3-E1细胞Wnt/β-catenin信号通路关键因子(+/-)p-β-catenin及下游靶蛋白如CyclinD1和c-Myc蛋白的表达情况。结果显示：γ-生育三烯酚和LiCl处理可使MC3T3-E1细胞的p-β-catenin蛋白表达量下调，同时可上调胞浆和核β-catenin的表达量，并可使与细胞增殖分化密切相关的靶蛋白CyclinD1、c-Myc蛋白表达量上调。然而，XAV-939阻断剂组、XAV-939阻断剂与γ-生育三烯酚联合用药组以及XAV-939阻断剂与LiCl联合用药组作用细胞后下调(+/-)p-β-catenin、胞浆及核β-catenin、CyclinD1、c-Myc蛋白的表达量。该结果显示β-catenin是γ-生育三烯酚对该信号通路的作用靶点。
　　研究结果表明4μmol/L的γ-生育三烯酚可以通过激活在骨形成中起核心作用的Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞增殖和分化。