【摘 要】
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木质纤维素是自然界中分布最广泛、含量最丰富的可再生资源。通过以生物信息学为指导的人工定向进化和结构功能域重组的方法可以提高纤维素酶的效率,降低利用木质纤维素生产燃料乙醇的成本。来源于白蚁的纤维素酶NtEG具有较高的纤维素催化效率并且只具有单个催化域,容易与进化距离较近的纤维素酶进行催化域置换。E4纤维素酶结合域对结晶纤维素结合能力较强。系统发育树分析发现NtEG与E4属于糖苷键水解酶家族9同一个亚
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木质纤维素是自然界中分布最广泛、含量最丰富的可再生资源。通过以生物信息学为指导的人工定向进化和结构功能域重组的方法可以提高纤维素酶的效率,降低利用木质纤维素生产燃料乙醇的成本。来源于白蚁的纤维素酶NtEG具有较高的纤维素催化效率并且只具有单个催化域,容易与进化距离较近的纤维素酶进行催化域置换。E4纤维素酶结合域对结晶纤维素结合能力较强。系统发育树分析发现NtEG与E4属于糖苷键水解酶家族9同一个亚类。将E4的结合域与NtEG的催化域进行结构域重组,形成重组纤维素酶。 本课题在生物信息学设计的基础上,用重组PCR技术将E4的结合域与NtEG的催化域进行结构域重组,构建了三组重组酵母工程菌X33/pGAPZαA-NtEG~1-E4~1,X33/pGAPZαA-NtEG~2-E4~2,X33/pGAPZαA-NtEG~3-E4~3,通过刚果红平板筛选具有表达活性的菌株,最后对有表达活性的菌株的表达产物进行酶活检测。 结果表明, X33/pGAPZαA-NtEG~2-E4~2成功表达重组纤维素酶,X33/pGAPZαA-NtEG~1-E4~1和X33/pGAPZαA-NtEG~3-E4~3没有表达预期的重组纤维素酶。用羧甲基纤维素法测活性为17.1 U /mL,用滤纸法测活性为5.4 U /mL,微晶纤维素测活性为4.6 U /mL。证明在毕赤酵母中成功表达了一种能够降解结晶纤维素的多功能重组纤维素酶。 本课题利用计算机辅助设计为结构域提供了详细的结构基础,筛选出最合理的重组方案,大大减少了实验和后期筛选的工作量,对其他借助生物信息学技术改造蛋白的尝试也有一定借鉴作用。
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