山核桃水通道蛋白CcPIP1在山核桃嫁接过程中的功能初步研究

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山核桃(Carya cathayensis Sarg.)重要的木本油料植物,是我国特有的名优干果和木本油料植物,具有很高的经济价值。嫁接是解决山核桃园艺化、良种化栽培的重要手段。水是植物细胞的重要组成成分,植物水通道蛋白是细胞间和细胞内水分快速运输的主要通道,作为植物水通道蛋白的一个亚类,质膜内在蛋白PIPs定位于原生质膜,为典型的高水分选择性通道蛋白。本文以不同处理的山核桃嫁接苗为材料,通过克隆山核桃CcPIP1启动子序列,利用定量RT-PCR等方法对山核桃水通道蛋白进行表达特性和功能的研究,主要研究结果如下:1.利用改良的CTAB法提取的嫁接样品总RNA质量高、完整性好、无杂质,利用SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit反转录获得的cDNA,完整性好,满足实验要求。2.根据已获得的CcPIP1基因的cDNA,在cDNA5’端设计反向特异引物WK1、WK2、WK3,以DNA酶切产物为模板,通过染色体步移法获得了CcPIP1基因上游部分序列,该序列全长为876bp。PlantCARE和PLACE等在线软件分析表明:该序列具有真核生物启动子序列的一般特征,2个CAAT box,7个TATA box和1个G-box。此外还找到了其他各类调控元件。3.利用定量RT-PCR技术,对不同处理(空白对照,50μM ABA,100mM NaCl,250mM甘露醇,和5mM DTT)在不同嫁接时期(0d,1d,3d,5d,7d,14d)山核桃CcPIP1基因的表达进行分析。结果表明:在对照中,山核桃CcPIP1基因的表达量从嫁接前到嫁接后3d急剧下降,在随后的4d里,该基因的表达量在接穗中上升明显,然后下降。在砧木中,嫁接1d后,该基因表达量急剧下降,在随后的6d里表达量上升明显。嫁接7d后,CcPIP1基因的转录水平达到最高,然后下降。无论在砧木还是在接穗中,嫁接后7d达到最高。通过ABA处理和NaCl处理山核桃CcPIP1基因的表达量的变化模式与对照相似。但与对照相比,NaCl处理的山核桃CcPIP1基因的表达量明显降低,而ABA处理的山核桃CcPIP1基因的表达量明显升高。通过DTT处理,CcPIP1基因的表达量在接穗和砧木中的表达模式都是先下降后上升。无论在砧木中还是在接穗中,嫁接1d后,CcPIP1基因的表达量急剧下降,在随后的13d时间里,基因的表达量逐渐上升,并于嫁接后14d达到最高。但是通过甘露醇处理可以看出,CcPIP1基因的表达量无论是在砧木还是接穗中都没有一定的规律。4.通过测定不同处理(空白对照,50μM ABA和5mM DTT)不同嫁接时期(0d,1d,3d,5d,7d,14d)的山核桃相对电导率,结果表明:在对照中,山核桃砧木和接穗的相对电导率在嫁接过程中逐渐下降。嫁接前,接穗的相对电导率为51.7%,到14d,相对电导率下降为39.2%。嫁接后,砧木的电导率变化较大,变化幅度在33%-72%之间。在ABA处理中,接穗和砧木的相对电导率在嫁接前分别为51.7%和45.4%,随后的时间里,相对电导率下降,14d相对电导率分别下降为33.6%和26.9%。在DTT处理中,接穗和砧木的相对电导率在嫁接后14d时间里相对电导率逐渐下降。
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