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前列腺癌是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤,占全球男性恶性肿瘤第二位（仅次于肺癌）。2021年,前列腺癌在美国的发病率居男性恶性肿瘤的首位,死亡率居第二位。尽管我国前列腺癌的发病率低于欧美国家,但是近10年来,由于社会老龄化、人口城市化、膳食结构西方化及血清前列腺特异性抗原（Prostate specific antigen,PSA）筛查的逐步推广,其发病率快速增长。值得注意的是,我国新确诊前列腺癌患者Gleason级别较高,临床分期偏晚,进展期合并转移比例高,多数患者已失去根治性手术机会。因此,如何进行前列腺癌的精准诊断和治疗是亟待解决的重大医学问题。雄激素-雄激素受体（Androgen receptor,AR）信号通路在前列腺癌的发生发展中发挥重要作用。目前,雄激素剥夺治疗（Androgen Deprivation Therapy,ADT）仍是进展期前列腺癌的首选治疗方案。尽管ADT可使体内雄激素水平显著下降,但几乎所有患者在治疗12～18个月后,最终转为去势抵抗性前列腺癌（Castration-resistant Prostate Cancer,CRPC）。目前研究表明去势后AR信号通路再激活是CRPC发生发展的主要原因。因此,AR抑制剂是晚期CRPC治疗的重要药物。恩杂鲁胺作为新一代AR拮抗剂,可以有效改善CRPC患者的预后,但是患者可在较短时间内产生恩杂鲁胺耐药性,临床上缺乏有效预测和逆转耐药的手段。我们前期基于课题组已建立的前列腺癌恩杂鲁胺耐药测序和生物信息分析平台,初步阐明了 KIF15通过稳定AR/ARV7蛋白促进前列腺癌恩杂鲁胺耐药的机制。RUVBL1 蛋白属于 AAA+（ATPases Associated With Diverse Cellular Activities,AAA）家族成员之一,是高度保守的AAA+ATPase。RUVBL1可参与复合物R2TP和TIP60的形成,调节基因的同源重组。RUVBL1也可以与保守的跨膜蛋白ITFG1相互作用,结合丝状肌动蛋白（F-actin）,促进外周肌动蛋白聚合,并增加细胞的运动性。RUVBL1在乳腺癌、非小细胞肺癌和肾细胞癌中高表达并与不良预后呈正相关。RUVBL1抑制剂CB-6644在急性粒细胞白血病和多发性骨髓瘤的异种移植肿瘤模型中,可显著抑制肿瘤细胞增殖。有初步研究提示RUVBL1在前列腺癌中可发挥转录调控作用,并且与DNA损伤修复有关。最近,我们发现RUVBL1在前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞中的表达明显升高;RUVBL1可能通过AR非依赖型途径,结合PLXNA1,激活CRAF/ERK/MAPK信号通路,促进恩杂鲁胺耐药的发生。本课题在多种细胞和动物模型平台上,检测到RUVBL1在前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞中表达升高;定位细胞质的RUVBL1通过调控PLXNA1-CRAF-MAPK信号通路发挥促进前列腺癌恩杂鲁胺耐药的作用;RUVBL1抑制剂可以有效延缓前列腺癌恩杂鲁胺耐药的发生。本研究主要分为两部分。第一部分RUVBL1促进前列腺癌恩杂鲁胺耐药如何延缓恩杂鲁胺耐药的发生或者使患者重新对恩杂鲁胺药物治疗敏感,在临床治疗中有重大意义。为明确RUVBL1在前列腺癌恩杂鲁胺耐药中的作用,我们从临床标本、细胞水平及动物水平三个不同层面探索RUVBL1在前列腺癌恩杂鲁胺耐药中的生物学作用,结果如下:1.RUVBL1在前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞及恩杂鲁胺耐药组织中高表达且与前列腺癌临床进展密切相关我们构建前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞系（LNCaP-ENZR和C4-2B-ENZR,亲本细胞LNCaP-Parental和C4-2B-Parental）。在细胞水平,qRT-qPCR和Western blot结果显示,与对照组相比,RUVBL1 mRNA和蛋白表达水平在恩杂鲁胺耐药组明显升高;对LNCaP及C4-2B细胞进行长期恩杂鲁胺刺激（大于1个月）后RUVBL1的mRNA和蛋白表达量均显著增加;在组织水平,免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）染色结果显示,与对照组织相比,RUVBL1蛋白表达水平在恩杂鲁胺耐药肿瘤中显著升高。前列腺癌恩杂鲁胺耐药数据库分析显示,与对照组相比,在前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞中RUVBL1 mRNA的表达水平明显升高。GEO（Gene Expression Omnibus）数据库及癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）等公共数据库分析结果显示:与正常前列腺组织相比,前列腺癌组织中RUVBL1mRNA的表达水平明显升高,与局限性前列腺癌组织相比,CRPC组织中RUVBL1 mRNA的表达水平显著升高,并且随着Gleason评分及病理分级的升高,RUVBL1 mRNA的表达水平呈逐渐升高趋势。IHC染色方法检测山东大学齐鲁医院171例前列腺癌样本,结果显示与局限性前列腺癌组织（n=142）相比,在CRPC组织（n=29）中RUVBL1的蛋白表达水平明显升高（28.17%vs 58.07%）。2.RUVBL1为雄激素反应性基因在雄激素敏感的LNCaP细胞中,使用外源双氢睾酮（Dihydrotestosterone,DHT）可以抑制RUVBL1在mRNA及蛋白水平的表达,而使用阿比特龙可以促进RUVBL1的表达。沉默AR表达后,RUVBL1 mRNA及蛋白表达水平显著升高,过表达AR后,RUVBL1mRNA及蛋白表达水平显著降低。AR ChIP结果显示,AR可以富集到RUVBL1的启动子区并抑制性转录调控RUVBL1的表达。3.RUVBL1过表达使前列腺癌细胞具有恩杂鲁胺耐药表型特征细胞增殖和细胞迁移及浸润实验结果显示,与对照组比较,RUVBL1低表达抑制LNCaP-ENZR和C4-2B-ENZR细胞增殖和细胞迁移及浸润能力,同时提高细胞对恩杂鲁胺敏感性;相反,在LNCaP-Parental和C4-2B-Parental中高表达RUVBL1促进前列腺癌细胞增殖、迁移和浸润能力,降低肿瘤细胞对恩杂鲁胺的敏感性。裸鼠皮下成瘤实验进一步说明,在C4-2B-ENZR中稳定敲低RUVBL1可明显抑制肿瘤生长。4.恩杂鲁胺刺激使细胞质定位RUVBL1表达升高蛋白质核质分离和免疫荧光法检测结果显示,与对照组相比,LNCaP-ENZR和C4-2B-ENZR细胞中高表达的RUVBL1蛋白主要定位于细胞质,恩杂鲁胺短期刺激也使前列腺癌细胞LNCaP和C4-2B胞质中RUVBL1分布增多。5.定位于细胞质的RUVBL1蛋白促进前列腺癌细胞的恩杂鲁胺耐药基于RUVBL1的细胞核定位依赖核定位序列,我们设计RUVBL1核定位序列突变质粒。在LNCaP-Parental和C4-2B-Parental细胞中分别过表达RUVBL1全长及核定位序列突变质粒后,结果显示,核定位序列突变对RUVBL1功能无明显影响,核定位序列突变质粒与RUVBL1全长质粒发挥相似的促进恩杂鲁胺耐药作用。第二部分RUVBL1通过调控PLXNA1-CRAF-MAPK通路促进前列腺癌恩杂鲁胺耐药及靶向RUVBL1逆转耐药的研究为进一步阐明RUVBL促进前列腺癌恩杂鲁胺耐药的分子机制,我们结合生物信息学、RNA-seq和蛋白质谱分析等,系统筛选RUVBL1的下游作用信号通路及结合蛋白,并通过体内外实验,从多层面解析了 RUVBL对MAPK信号通路的调控机制,得到了以下结果:1.RUVBL1与AR信号通路无相关性蛋白质核质分离和Western blot结果显示,在LNCaP-Parental和C4-2B-Parental细胞中过表达RUVBL1,在LNCaP-ENZR和C4-2B-ENZR细胞中沉默RUVBL1,AR蛋白表达水平及核质分布无明显改变。2.RUVBL1与MAPK信号通路具有相关性在C4-2B-ENZR细胞干扰RUVBL1送检RNA-seq,并对干扰RUVBL1后下调的基因进行集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）,结果显示MAPK信号通路基因集富集在RUVBL1低表达组。Western blot及IHC结果显示,LNCaP-Parental、C4-2B-Parental、LNCaP-ENZR 和 C4-2B-ENZR 细胞中 RUVBL1高表达促进 MAPK 信号通路激活,裸鼠组织中RUVBL1低表达抑制磷酸化ERK的表达水平,并且RUVBL1抑制剂CB-6644可以显著抑制RUVBL1高表达导致的ERK的磷酸化水平升高。3.PLXNA1和CRAF是RUVBL1重要互作蛋白结合文献报道及RUVBL1蛋白质谱,筛选出RUVBL1重要互作蛋白丝氨酸-苏氨酸激酶 1（Raf-1 proto-oncogene,CRAF）和丝状蛋白 A1（plexin A1,PLXNA1）。免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）实验结果显示,在 LNCaP-ENZR和 C4-2B-ENZR细胞中RUVBL1与CRAF和PLXNA1存在内源性结合。4.RUVBL1-PLXNA1-CRAF蛋白复合物主要定位于细胞质Co-IP结果显示:与对照组细胞相比,前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞中RUVBL1与CRAF和PLXNA1结合更多。核质分离Co-IP免疫荧光及荧光能量共振转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）结果显示,C4-2B-ENZR 细胞中RUVBL1-PLXNA1-CRAF蛋白的相互结合主要定位于细胞质。5.RUVBL1促进PLXNA1与CRAF蛋白结合Co-IP结果显示:在LNCaP-ENZR和C4-2B-ENZR细胞中干扰RUVBL1的表达,PLXNA1与CRAF的相互结合减少,在LNCaP-Parental和C4-2B-Parental细胞中过表达RUVBL1,PLXNA1与CRAF结合显著增多。6.RUVBL1通过增强PLXNA1与CRAF蛋白的相互作用调控MAPK信号通路Western blot 结果显示:在 LNCaP-ENZR 和 C4-2B-ENZR 细胞中干扰 RUVBL1,同时过表达PLXNA1或干扰PLXNA1,与对照组相比,单一过表达PLXNA1组CRAF及ERK1/2、MEK蛋白的磷酸化水平明显升高,而在干扰RUVBL1同时过表达PLXNA1组CRAF及ERK1/2、MEK蛋白的磷酸化水平改变不明显。使用PLXNA1配体Sema3A Fc活性蛋白刺激细胞,结果显示,与对照组相比,干扰RUVBL1组CRAF蛋白的磷酸化水平增加不明显。7.RUVBL1抑制剂抑制前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞增殖和肿瘤形成基于RUVBL1可能是逆转恩杂鲁胺耐药的新颖治疗靶标,我们使用RUVBL1特异性抑制剂CB-6644进行了进一步的体内外实验。细胞增殖实验结果显示,恩杂鲁胺联合应用CB-6644可以提高LNCaP-ENZR和C4-2B-ENZR细胞对恩杂鲁胺的敏感性、抑制前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞的增殖。裸鼠皮下成瘤实验结果显示,与对照组相比,CB-6644处理组前列腺癌恩杂鲁胺耐药裸鼠肿瘤的体积增长显著减慢。更重要的是,与单独加入恩杂鲁胺或CB-6644比较,两者联合用药后可以更有效的抑制恩杂鲁胺耐药性前列腺癌细胞增殖。综上所述,RUVBL1可在细胞质中与PLXNA1和CRAF结合,通过CRAF介导的磷酸化途径调控MAPK信号通路活化水平,从而促进前列腺癌恩杂鲁胺耐药。RUVBL1抑制剂可有效抑制RUVBL1过表达引起的前列腺癌恩杂鲁胺耐药细胞的增殖和肿瘤生长,并且和恩杂鲁胺联合应用时可更加有效地延缓前列腺癌恩杂鲁胺耐药的发生和进展。