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癫痫是由广泛皮层神经元或部分脑区神经元异常同步化放电所致的一组疾病。此过程中,细胞内外离子分布和转运异常起明显的作用。这些离子进出细胞受离子通道的调节,调节环节的异常可以促发癫痫。遗传学研究证实在许多家族遗传性癫痫病人中发现了离子通道的基因突变,如良性新生儿家族性惊厥(benignfamilialneonatalconvulsions,BNFC)被证明是编码电压门控M型钾通道KCNQ2和KCNQ3基因发生突变,引起细胞膜电位异常而导致癫痫发作。
钾离子通道为分布最广、类型最多的一类离子通道,主要参与细胞膜静息电位和动作电位复极化过程的调节,决定动作电位的发放频率和幅度。A型钾通道是电压依赖性钾通道(Kv)家族成员,广泛分布于哺乳动物海马神经元上,分为树突A型钾通道和突触A型钾通道。树突A型钾电流主要由Kv4.2构成,具有快速激活和失活的特性。该外向型电流可在低阈值下激活,使动作电位的潜伏期延长,降低兴奋性突触后电位(excitatorypostsynapticpotential,EPSP)和反向传播电位的幅度,从而降低树突、胞体兴奋性。
Kv4.2功能可受多种调节因素影响,其中钾通道相互作用蛋白(Kvchannelinteractingproteinl,KChIP1)可与Kv4α亚基疏水N端结合,起到结构调节及动力学调节作用。在缺乏KChIP结合表达的情况下,出现Kv4.2半衰期明显缩短。在海人酸致大鼠癫痫模型中的研究显示Kv4.2在癫痫持续状态后表达降低。我们的研究发现KChIP1在癫痫模型中表达发生改变,因此推测KChIP1与Kv4.2可能共同在癫痫的发生的前期中起重要作用。
本实验第一部分:用免疫组化染色方法探究正常成年SD大鼠脑中Kv4.2分布情况,用免疫荧光染色方法观察KChIP1、Kv4.2在不同脑区的共定位,了解两者在大脑中的相互作用的解剖学基础,有助于分析生理状况下KChIP1对Kv4.2通道的调节作用。本实验第二部分:建立匹罗卡品大鼠癫痫模型,应用免疫印迹方法检测癫痫持续状态后各时间点海马和皮层中Kv4.2与KChIP1蛋白表达量变化,同时免疫组化染色方法观察Kv4.2在脑中的分布改变,探讨Kv4.2与KChIP1在癫痫发生发展中的机制。
【材料与方法】选用成年健康雌性清洁级SD大鼠,体重200-230g,制作大脑冰冻切片,用免疫组织化学反应、DAB染色法观察Kv4.2在脑中的分布。用抗鼠FITC、抗兔TRITC两种荧光二抗与Kv4.2、KChIP1抗体反应,在共聚焦显微镜下扫描,观察二者分布与细胞亚定位的相关性和差异性。制作氯化锂—匹罗卡品癫痫模型按癫痫持续状态终止后0h、1h、3h、6h、24h、48h、50d分为7个组,并分别设相应对照组(以生理盐水替代匹罗卡品注射),模型制作未成功大鼠亦相应分组。提取海马组织全细胞蛋白、皮层组织全细胞蛋白,并进行蛋白定量。将蛋白进行电泳分离、转膜,与Kv4.2抗体反应后,应用化学发光剂对蛋白进行检测。用灰度分析软件扫描所得蛋白质条带,研究致痫后Kv4.2、KChIP1蛋白表达变化。两组大鼠制作大脑冰冻切片,用Kv4.2抗体进行免疫组织化学反应、染色,了解癫痫发作后Kv4.2分布变化。本试验所得数据用t检验,p<0.05为有显著差异,p<0.01为有非常显著差异。
【结果】Kv4.2在正常SD大鼠大脑中表达广泛。。Kv4.2与KChIP1的分布具有高度的一致性,两者在胞体及近端树突的细胞膜上均有较强的阳性信号。
癫痫发作后海马的Kv4.2蛋白与KChIP1水平不同程度升高,而注射匹罗卡品未发作组与对照组无明显差异。将每组的条带进行灰度分析,数值标准化后进行数据统计,结果Kv4.2蛋白在癫痫发作后3h、6h、24h、48h有统计学意义的升高,而在慢性期50天后低于正常水平,统计结果未见显著差异。KChIP1在癫痫发作后3h、6h、24h具有统计学意义的升高,48h、50d后降至正常水平。两者的升高的峰值时间不同,Kv4.2在6h、24h升高最为显著,KChIP1在3h最为显著。与海马相比,皮层KChIP1与Kv4.2蛋白的总体表达水平较高,在癫痫发作后,Kv4.2蛋白与KChIP1表达水平轻度升高,但仅Kv4.2蛋白在24h的升高有统计学意义。
【结论】1、Kv4.2蛋白在成年SD大鼠脑中分布广泛,表达丰富。Kv4.2与KChIP1在皮层、海马具有高度的共定位性。
2、匹罗卡品癫痫大鼠模型急性期皮层、海马中Kv4.2表达水平短暂增高,慢性期轻度下降。其作用可能是机体通过降低神经元兴奋性,阻止脑内兴奋性冲动扩散,是一种对神经元过度兴奋的代偿性自我保护反应。
3、匹罗卡品癫痫大鼠模型急性期海马中KChIP1表达水平短暂增高,表达改变的时间较Kv4.2提前,提示了KChIP1可能参与了癫痫过程中的兴奋性调节机制,Kv4.2在急性期表达上调的机制可能与KChIP1的表达增加有关。