论文部分内容阅读
端粒酶（Telomerase）是一种具有催化作用的核糖蛋白逆转录酶，由3个亚单位组成。其中端粒酶RNA（TR）和端粒酶逆转录酶（TERT）是端粒酶发挥催化作用的关键部分，TR提供模板，TERT逆转录合成端粒DNA复制过程可将真核细胞端粒DNA加至染色体末端，防止染色体末端端粒DNA因细胞分裂而缩短；细胞中端粒缩短将导致其复制能力受到一定的限制，从而降低细胞的增殖能力。研究表明端粒酶在人正常体细胞中其活性受到相当严格的调控，仅在造血干细胞、生殖细胞及干细胞等生命力旺盛的细胞中可以检测到端粒酶的活性，其他正常体细胞中端粒酶的活性一般受到抑制，而在肿瘤细胞中却被从新激活，从而参加恶性肿瘤的转化。端粒酶在保持细胞中染色体末端端粒DNA稳定性及完整性具有重要作用。酵母端粒酶是一个理想的研究模型。为了深入研究酵母端粒酶的结构与分子作用机理，本实验主要是研究酵母端粒酶RNA的核心区域，其最终目的是与端粒酶的活性催化单位（TERT）结合研究其结构与分子机理。本实验首先是自行纯化T7RNA聚合酶，然后利用一种具有自剪切能力的核酶HH和HDV体外制备高度纯化的端粒RNA的功能区域，同时研究了其在各种条件下的稳定性和有利于正确折叠的物理因素，为进一步研究端粒RNA的结构及功能提供了生物材料依据，也将为深入研究端粒酶奠定基础。主要获得了一下研究结果：（1）探索出一种快速提纯T7RNA聚合酶的方法，即：串联SP-FF和DEAE-FF柱的方法,利用SP强阳离子交换柱和DEAE弱阴离子交换柱快速高效的纯化了T7RNA聚合酶；通过体外转录检测其活性强，转录出的RNA降解现象不明显。（2）用限制性内切酶PstI和NgoMIV双酶切HH-Yeast-pES质粒，用限制性内切酶PstI和NgoMIV双酶切质粒pSP72-Cabullse-HDV，利用连接酶将PstI-Yeast-HH-239-NgoMIV基因片段定向克隆到pSP72-Cabullse-HDV （PstI/NgoMIV）上，得到含有T7promoter、核酶HH、核酶HDV和Yeast-RNA-239的pSP72-HH-Yeast-HDV-239重组质粒。以pSP72-HH-Yeast-HDV-239为模板PCR扩增获得EcoRI-Yeast-HDV-239-XhoI和EcoRI-Yeast-239-XhoI基因片段，用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切pSP72-Cabullse-HDV质粒，用EcoRI和XhoI双酶切EcoRI-Yeast-239-HDV-XhoI和EcoRI-Yeast-239-XhoI基因片段，再用连接酶定向克隆到pSP72-Cabullse-HDV （EcoRI/XhoI）上，分别获得含有T7promoter、核酶HDV和Yeast-RNA-239的载体pSP72-Yeast-HDV-239及含有T7promoter和Yeast-RNA-239的载体pSP72-Yeast-239。（3）用XhoI线性化pSP72-Yeast-HDV-239重组质粒进行体外转录，利用分子筛SuperDex-200纯化目标酵母端粒RNA Yeast-RNA-239，获得了高度均一的酵母端粒RNAYeast-RNA-239。（4）将酵母端粒RNA（Yeast-RNA-239），溶于分别含有不同浓度Na+、Mg2+不同缓冲液中，随着金属离子浓度的增加，酵母端粒酶RNA出现两种不同的构型，证明了Na+、Mg2+浓度对酵母端粒RNA的构型有一定的影响。（5）在不同浓度四膜虫端粒酶相关蛋白p65条件下转录酵母端粒RNA，伴随着蛋白p65浓度的增加，形成一条较为均一致密的结构，表明四膜虫端粒酶相关蛋白p65能与酵母端粒RNA有效结合。