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多糖是生物体内除蛋白质和核酸外的又一类重要的生物大分子物质,具有增强免疫、抗癌、抗衰老、抗氧化等多种生物活性。研究发现,硫酸化修饰可以进一步提高多糖的生物活性,并能产生许多新的药用价值,尤其是赋予或增强其抗病毒和增强免疫活性而倍受关注。本研究首先用一步醇沉和分步醇沉法提取银耳总多糖和3个分级银耳多糖,比较了它们的抗病毒和增强免疫活性,筛选出2个效果较好的活性部位；然后用正交实验优化了银耳多糖的硫酸化修饰条件并进行硫酸化修饰,得到2个硫酸化银耳多糖；同时,以本研究室前期优化的党参多糖修饰条件对筛选出的2个党参多糖活性部位进行硫酸化修饰,得到2个硫酸化党参多糖；最后,比较了4个硫酸化多糖的抗病毒和增强免疫活性。试验分为以下九个部分：试验Ⅰ 银耳多糖的提取 采用湿法粉碎、超声波破壁,水煎一步醇沉和分步醇沉法提取粗的银耳总多糖TPStc和3种分级银耳多糖TPS60c、TPS7oc和TPS80c,分别用苯酚-硫酸法和考马斯亮兰法测定多糖和蛋白含量。结果显示,银耳多糖的提取率以TPStc最高、达6.39%,分级银耳多糖的提取率以TPS7oc最高、达3.86%；各多糖的糖含量以TPS70c最高、达86.23%；银耳总多糖和3种分级多糖的蛋白含量较低。结果表明,复水完全的银耳子实体经湿法粉碎、超声波处理可以提高银耳多糖的提取率。试验Ⅱ 银耳多糖体外对新城疫病毒感染细胞能力的影响 为了筛选银耳多糖抗病毒的活性部位,首先用MTT法测定银耳总多糖TPStc和3个分级多糖TPS60c、TPS70c和TPS80c对鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度；然后取安全浓度范围内5种浓度的各多糖与鸡新城疫病毒(NDV)以3种加药方式(先加多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、多糖和病毒感作后)加入到长成单层的CEF培养体系中,用MTT法比较各多糖对鸡新城疫病毒感染细胞能力(细胞A570值和最高病毒抑制率)的影响。结果表明,4种银耳多糖在3.907～62.5 u g·mL-1、在3种加样方式多可显著抑制病毒感染细胞；先加多糖后接种病毒时TPS8oc在62.5μg·mL-1组的病毒抑制率最高,先接种病毒后加多糖时TPStc在3.907μ g·mL-1时的病毒抑制率最高,多糖和病毒感作后加时TPS60c在3.907 μ g·mL-1时的病毒抑制率最高。综合比较以TPStc的作用最好,可能是银耳多糖抗病毒活性的最佳部位。试验Ⅲ 银耳多糖体外对鸡外周血淋巴细胞增殖的影响 为了筛选银耳多糖增强免疫的活性部位,将安全浓度范围内5种浓度的银耳总多糖TPStc和分级多糖TPS60c、TPS70c和TPS80o,分别单独或与PHA同时加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖(细胞A570值和最高淋巴细胞增殖率)的变化。结果表明,多糖单独刺激时TPS70c在3.907～62.5μg·mL-1、TPStc在31.25μg·mL-1能显著促进淋巴细胞增殖,TPStc在31.25 μ g·mL-’组的淋巴细胞增殖率最高；多糖与PHA共同刺激时,TPS70c在15.625～31.25 μg·mL-1、TPStc在15.625μg·mL-1能显著促进淋巴细胞增殖,TPS70c在15.625 μ g·mL-1组的淋巴细胞增殖率最高。综合评价以TPS7oc的效果最好,可能是银耳多糖增强免疫活性的最佳部位。试验Ⅳ银耳多糖的纯化和硫酸化修饰条件的优选 首先取TPStc依次过DEAE-Sepharose Fast Flow柱、Sephadex G-200凝胶柱层析,得到纯化的银耳多糖TPStp；然后以取代度和产物量为指标,采用L9(34)正交设计对试剂配比、反应温度、反应时间等修饰条件进行优选,用氯化钡-明胶法测定硫酸基的取代度(DS)。结果表明,经纯化后银耳多糖的糖含量提高；反应温度对取代度和产物量的影响最大,反应温度为80℃时,取代度和产物量最高(1.62和512.4 mg)。综合考虑银耳多糖硫酸化修饰的最佳条件为氯磺酸与吡啶的配比为1：6、反应温度80℃、反应时间1.5 h。试验V两种硫酸化多糖体外对新城疫病毒感染细胞能力的影响 用优化的硫酸化修饰条件对TPStp和TPS70c进行硫酸化修饰,得到2个硫酸化银耳多糖sTPStp和sTPS70c；用以本研究室前期优化的党参多糖修饰条件对筛选出的2个党参多糖活性部位GPPStp和CPPSsoc进行硫酸化修饰,得到2个硫酸化党参多糖sCPPStp、sCPPS50。；用MTT法测定4个硫酸化多糖和未修饰的TPSt。对CEF的安全浓度；然后取安全浓度范围内5个浓度的各多糖,分别与新城疫病毒(NDV)以3种加药方式加入到长成单层的CEF的培养体系中,用MTT法比较它们对新城疫病毒感染细胞能力(细胞A570值和最高病毒抑制率)的影响。结果显示,5个多糖在0.391～6.25 μ g·mL-1在3种加样方式均可显著抑制病毒感染细胞；先加多糖后接种病毒时sTPStp在1.563 μ g·mL-1组的病毒抑制率最高,先接种病毒后加多糖时sTPStp在1.563 u g·mL-1时的病毒抑制率最高,多糖和病毒感作后加时sCPPSsoc在6.25μg·mL-1时的病毒抑制率最高。结果表明,硫酸化修饰可以提高多糖的抗病毒活性,以sTPStp的作用最强,其次为sTPS,0c,且与硫酸基取代度有一定的相关性。试验Ⅵ两种硫酸化多糖体外对鸡外周血和脾脏淋巴细胞增殖的影响为了比较上述4个硫酸化多糖的体外增强免疫作用,取安全浓度范围内5个浓度的4个硫酸化多糖和未修饰的TPStp，分别单独或与PHA一起加入到培养的鸡外周血淋巴细胞中,单独或与LPS一起加入到培养的鸡脾脏淋巴细胞中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果显示,多糖单独加入到外周血淋巴细胞时,4个硫酸化多糖几乎所有浓度、TPS,p仅在3.125 μ g·mL-1显著刺激细胞增殖,sCPPStp在0.391μg·mL-1时的淋巴细胞增殖率最高；多糖与PHA同时加入到外周血淋巴细胞时,sCPPS50c在0.391～1.563μg·mL-1、 sTPStp在0.782μg·mL-1、sCPPStp在125μg·mL-1显著刺激细胞增殖,sCPPS50c在0.782μg·mL-1的细胞增殖率最高；多糖单独加入到脾淋巴细胞时,4个硫酸化多糖在3～5个浓度、TPStp仅在3.125 u g·mL-1显著刺激细胞增殖,sCPPStp在3.125 μ g·mL-1时的细胞增殖率最高；多糖与LPS同加入到脾淋巴细胞时,5个多糖在6.25μg·mL-1、 sTPS70c在0.781μg·mL-1、 sCPPStp在3.125 u g·mL-1显著刺激细胞增殖,sTPS70c在0.781 μ g·mL-1时的细胞增殖率最高。结果表明,硫酸化修饰可以提高多糖的增强免疫活性,以sGPPS50c的作用最强,且与取代度有一定的相关性。试验Ⅶ两种硫酸化多糖对鸡新城疫疫苗免疫应答的影响 为了比较上述4个硫酸化多糖的增强免疫作用,测定了4个硫酸化多糖对鸡新城疫苗免疫效果的影响。14日龄雏鸡476只随机均分为17组,除空白对照组外均用新城疫IV系苗免疫,28日龄二免。在首次免疫的同时,6个硫酸化银耳多糖组、6个硫酸化党参多糖组和3个银耳多糖对照组分别肌肉注射高、中、低剂量的sTPStp、sTPS70c、sCPPStp、和TPStp,无佐剂对照组注射等量生理盐水。分别于首次免疫后第7、14、21、28 d翼静脉采血检测血清HI抗体效价,心脏采血测定外周血T淋巴细胞增殖的变化。结果表明,4个修饰多糖在合适的剂量和某些时间点能显著提高血清抗体效价、促进T淋巴细胞增殖,而未修饰多糖的作用均不显著。综合评价以sTPS7oc中剂量的作用最好, sCPPS50c中剂量次之。试验Ⅷ两种硫酸化多糖对鸡新城疫的疗效比较 为了比较两种硫酸化多糖的体内抗病毒作用,测定了4个硫酸化多糖对鸡人工感染新城疫的疗效。27日龄雏鸡245只随机均分为7组,除空白对照组外均用新城疫强毒攻毒,6 h后4个硫酸化多糖组和多糖对照组分别注射4个硫酸化多糖和未修饰的TPStp,攻毒对照组和空白对照组注射等量生理盐水,每天1次,连续3 d。每天观察鸡群发病和死亡情况,连续观察14 d,统计死亡率、痊愈率、显效率和总有效率；分别于攻毒前1天和攻毒后第3、7、14 d翼静脉采血测定血清抗体效价。结果显示,各多糖组的死亡率均低于、总有效率均高于攻毒对照组,sTPS7oc组的死亡率最低,痊愈率和总有效率最高；在攻毒后各多糖组的抗体效价均高于攻毒对照组,sTPS70c组在各时间点的抗体效价最高,显著高于攻毒对照组。结果表明,各多糖对人工感染鸡新城疫有一定的疗效,sTPS70c的作用最好。试验Ⅸ两种硫酸化多糖对鸡外周血淋巴细胞IL-2 mRNA表达的影响 为了研究两种硫酸化多糖sTPS7oc和sCPPS5oc增强免疫的作用机理,测定了2个硫酸化多糖对鸡外周血淋巴细胞IL-2 mRNA表达的影响,以未修饰的TPStp为对照。培养鸡外周血淋巴细胞,分别加入3种浓度的sTPS70c、sCPPS50c和TPStp,培养12 h后收集细胞,提取总RNA,用荧光定量RT-PCR方法测定淋巴细胞lL-2 mRNA的表达。结果显示,sTPS70c组在1.563μg·mL-1促进外周血淋巴细胞IL-2 mRNA的表达、显著强于PHA和未修饰的TPS,并且具有一定的剂量反应关系。