论文部分内容阅读
背景 管癌预后较差,缺乏有效治疗药物,因此亟需寻找有效的抗胆管癌药物。鞘氨醇激酶(Sphingosine kinase,SPHK)是鞘磷脂代谢调控中的关键激酶,负责将促进凋亡的鞘氨醇(Sphingosine,Sph)磷酸化为具有促进存活作用的1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)。研究发现SPHK在很多肿瘤中过表达,并且具有促进肿瘤发生发展的作用,是肿瘤治疗的新靶点。SPHK有两种异构体SPHK1和SPHK2。研究发现在胆管癌细胞中,SPHK2的表达明显较SPHK1高,同时S1P可以促进胆管癌细胞的增殖和迁移,因此SPHK2/S1P通路可能是胆管癌治疗的潜在靶点。ABC294640是SPHK2的第一个特异性较强的小分子抑制剂,且具备口服生物利用度高、毒副作用低等优点,在多种肿瘤模型中显示具有较好的抗肿瘤作用。我们前期发现ABC294640具有抑制胆管癌细胞增殖和促进凋亡的作用。在ABC294640的I期临床试验中,共纳入21例晚期实体瘤患者,其中3例晚期胆管癌患者服用ABC294640治疗后效果最好,提示ABC294640可能具有独特的抗胆管癌作用。目前ABC294640针对胆管癌的II期临床试验已经开展。但是ABC294640抗胆管癌的机制尚不清楚,临床上是否有其他药物可以进一步增强ABC294640的抗胆管癌效果亦值得进一步探究。因此,本研究拟从着重探究ABC294640的抗胆管癌机制,并探究ABC294640与BCL2/BCL-XL的抑制剂是否具有协同抗胆管癌作用。方法 过ABC294640处理人胆管癌细胞株后,使用Real-time qPCR检测BCL2家族成员NOXA、MCL1等基因的mRNA表达水平,Western blot检测相应的蛋白表达水平。通过小干扰RNA(SiRNA)沉默NOXA后,分别使用CCK-8和流式细胞术及Western blot检测对ABC294640抗胆管癌效果的影响。通过TCGA数据分析NOXA与胆管癌的预后相关性。ABC294640与ABT-263及Obatoclax联合使用后,使用CCK-8检测细胞活力,通过CompuSyn软件计算ABC294640与ABT-263及Obatoclax的联合指数(CI),用流式细胞术和Caspase 3/7活性试剂盒检测细胞凋亡。通过免疫组化检测SPHK2及MCL1在胆管癌中的表达情况及表达相关性。结果 BC294640可以抑制HCCC9810和RBE细胞的增殖并促进凋亡。ABC294640可以明显升高NOXA的mRNA和蛋白表达。SiRNA沉默NOXA后可以逆转ABC294640的抗胆管癌效果。分析TCGA数据发现高表达NOXA的胆管癌患者预后更好。我们同时发现ABC294640可以显著下调MCL1的蛋白表达水平,但不降低MCL1的mRNA表达水平,同时不影响BCL2及BCL-XL的蛋白表达水平。使用蛋白酶体抑制剂MG132预处理后可以逆转ABC294640对MCL1的抑制作用,提示ABC294640通过蛋白酶体途径促进MCL1的降解。进一步实验发现SiRNA沉默NOXA后可以逆转ABC294640对MCL1的抑制作用。同时ABC294640与ABT-263及Obatoclax联合使用后,较单药相比可以明显抑制胆管癌的活力,联合指数<1,提示具有协同作用。ABC294640与ABT-263及Obatoclax联合使用后细胞凋亡亦较单药组明显升高。使用MCL1的小干扰沉默MCL1可以提高ABT-263的促胆管癌凋亡作用。免疫组化提示SPHK2及MCL1在胆管癌组织中的表达均明显高于癌旁正常胆管上皮,且SPHK2与MCL1的表达呈正相关。结论 BC294640可以诱导促凋亡蛋白NOXA的表达,促进抗凋亡蛋白MCL1的降解,进而抑制胆管癌细胞存活,促进胆管癌细胞凋亡,并与ABT-263及Obatoclax联合使用后产生协同抗胆管癌作用。因此,ABC294640与BCL2/BCL-XL抑制剂的联合使用可能是胆管癌治疗的新策略。