研究背景糖尿病的发病率逐年上升,糖尿病对患者最大的威胁来自其并发症,其中,糖尿病创面(diabetic wound)已成为严重威胁糖尿病患者生存和生活质量的严重并发症,具有难治愈、易感染、高截肢率的特点。糖尿病创面已成为患者迫切需要解决的医学难题之一。2010年《新英格兰杂志》有文章报道,中国目前正在进入糖尿病性溃疡的的高发期。在我国20岁以上的成人中,糖尿病患病率达9.7%(9240万糖尿病患者),糖尿病前期的患病率达15.5%(1482万糖尿病前期患者)[1]。糖尿病创面愈合机制复杂,其分子机制尚未完全阐明。而目前临床常用治疗手段仍局限于传统治疗,治疗效果尚不理想。因此,如何有效促进糖尿病创面愈合已成为多学科共同关注的课题,攻克糖尿病创面的治疗仍需要新的策略和突破点。正常创面愈合是复杂而有序的过程,分为三个阶段,即炎症期、增殖期和塑型期,有多种细胞、细胞因子和细胞外基质等因素共同参与。分化相关的生长因子如成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)等,调节成纤维细胞、血管内皮细胞及角质形成细胞此类修复细胞的活化、增殖,促进大量新生毛细血管生成,与胶原及细胞外基质构成肉芽组织,同时增殖的角质形成细胞将创面覆盖,随后肉芽组织改造塑型,从而完成创面愈合过程。其中,创面血管新生及肉芽组织的形成在创面愈合中是关键环节。内皮细胞增殖、分化、迁移进而融合成初级血管网,随后此初级血管网启动重塑过程,以出芽方式生长、分支,不断募集支持细胞,最终发展为成熟的脉管系统[2]。当血管内皮细胞足够多的情况下,功能性血管的装配对创面血管化及愈合过程具有更重要的意义。糖尿病患者皮肤易受损伤,损伤后迁延不愈或反复发作,极易形成难愈性创面(non-healing wound)。糖尿病创面愈合过程紊乱,尤其在炎症期和增殖期[3,4]。目前糖尿病创面愈合延迟或难愈合的机制尚未完全阐明,一般认为是多因素的综合作用,主要包括血管、神经和代谢等多重因素所致。其中,糖尿病患者血管病变,皮肤创面中新生血管生成(angiogenesis)迟滞,阻碍肉芽组织的形成,可能是糖尿病创面难愈的重要原因[5]。血管化低下或者供血不足是糖尿病难愈创面的病理特征[6],临床上糖尿病患者创面可见新鲜肉芽组织有明显缺乏现象[7]。肉芽组织中的主要成分是新生血管,能够为创面愈合组织提供氧气养料并带走代谢产物,在创面愈合过程中起到关键作用[8]。新生血管的缺乏,可能导致创面愈合延迟甚至不愈合。因此,创面形成后局部如何促进新生血管生成值得深入研究。有实验报道[9],糖尿病皮肤创面中发现新生血管内皮细胞数量不足或者功能低下,与其增殖能力下降和凋亡增加有关。同时,有研究对2型糖尿病大鼠内皮细胞的生长因子的表达以及血管新生进行分析,结果显示在体外糖尿病大鼠心肌微血管内皮细胞的新生血管生成能力下降,而细胞中转录后异常导致的VEGF及其受体表达的减少可能是糖尿病新生血管生成能力受损的原因。因此,靶向糖尿病创面血管新生的系统研究,有助于发展促进糖尿病创面修复的新的治疗方法[10]。在分子水平机制上,生长因子在创面愈合过程中通过信号通路调节细胞活性。研究显示低氧诱导因子1(Hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)在创面愈合过程中发挥了关键作用。作为低氧调节中的关键转录因子,到目前为止,HIF信号途径所调节的靶基因可能超过100余种,其中包括血管(淋巴管)生成相关因子(VEGF/VEGFR,ANG-1/2,IGF-2),细胞增殖相关因子(cyclinD1),能量代谢相关因子(ALDA,GLUT-1/3,PFK1,LDHA)等(见表1)。创面形成后,局部处于低氧状态,HIF-1通过对这些基因表达的调节,改变修复细胞增殖、分化、衰老、凋亡,促进组织血管化等[11,12]。HIF-1是一个由HIF-1α和HIF-1β两个亚基构成的异二聚体复合物。HIF-1的生理活性是由HIF-1α亚基的活性和表达决定的。在正常氧浓度条件下,细胞内HIF-1α的表达量维持较低水平,易于泛醌化(ubiquitination)被蛋白酶水解。当细胞处于低氧时,HIF-1α的转录和翻译水平将呈指数倍增加。HIF-1α与HIF-1β结合形成有活性的二聚体HIF-1,抵抗蛋白水解酶的降解。除低氧调节之外,HIF-1亦可通过生长因子、下调的癌基因、和/或肿瘤抑制物等非氧依赖机制激活或影响其表达。低氧条件下,HIF脯氨酰羟化酶(HIF prolyl hydroxylases,PHDs)调节 HIF-1 的表达,而 PI3K/Akt和MAPK途径介导主要是非低氧依赖的HIF调控[1](图2-1)。在创面愈合过程中,HIF-1α通过对血管生成因子的调节促进新生血管生成,越来越多的研究证明了 HIF-1在创面愈合中发挥了关键作用[14]。一系列的证据提示HIF-1影响创面床的再上皮化,因为它抑制角质形成细胞增殖但同时可以促进角质形成细胞的迁移。然而,研究显示葡萄糖和高血糖使得HIF-1α的稳定性和功能受损[15,16]。在一些难愈创面如老年小鼠和糖尿病小鼠创面,HIF-1的水平及活性均有减少[11,17]。以往有研究显示下肢皮肤组织中HIF-1和VEGF的表达下降能够导致血管密度减少,血液循环差,创面愈合不良,这是糖尿病足损伤的重要原因[18-20]。HIF-1α基因治疗显示在肢体缺血的小鼠模型中联合治疗对组织灌流有协同效应[20]。然而,糖尿病患者创面愈合过程中,引起HIF-1信号途径受损的分子机制尚未阐明,促使我们对这一病理改变进一步深入探讨。表1 HIF-1作用的靶基因Table 1 Gene targets for hypoxia inducible factor 1 Role Gene product Red cell production Erythropoietin Iron metabolism Transferrin,transferrin receptor,ceruloplasmin Angiogenesis VEGF,PAI-1,adrenomedullin,endothelin-1,nitric oxide synthase,haemoxygenase-1,α1β-adrenoreceptor pH control Carbonic anhydrases 9 and 12 Matrix metabolism Prolyl-4-hydroxylase-al,collagen V-a1,urokinase plasminogen activator receptor,MMP-2 Glucose Metabolism Glu1 and 3,hexokinase 1 and 2,phosphofructokinase L,aldolase A and C,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,phosphoglycerate kinase 1,enolase 1,pyruvate kinase M,lactate dehydrogenase A,adenylate kinase 3 Cellular growth/cell cycle Insulin-like binding factors 1,2 and 3,insulin like growth conctrol factor Ⅱ,TGF-β3,p21,Nip3,Cyclin G2,differentiated chondrocyte 1 Negative feedback p5 3 Erythropoietin:促红细胞生成素;Transferrin:转铁蛋白;transferrin receptor:转铁蛋白受体;ceruloplasmin:血浆铜蓝蛋白;PAI-1:plasminogen activator inhibitor纤溶酶原激活物抑制剂;adrenomedullin:肾上腺髓质素;endothelin-1:内皮素-1;nitric oxide synthase:一氧化氮合酶;haemoxygenase-1:血红素加氧酶-1;α1β-adrenoreceptor:肾上腺素受体;Carbonic anhydrases:碳酸酐酶;collagen V-a1:胶原V-a1;urokinase plasminogen activat or receptor:尿激酶纤溶酶原活化因子受体;MMP-2:matrix metalloproteinases基质金属蛋白酶;GLU:Glucose transporter葡萄糖转运体;phosphofructokinase:磷酸果糖激酶,aldol ase A and C(醛缩酶A,C),glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase:甘油醛-3-磷酸脱氢酶;phosphoglycerate kinase:磷酸甘油酸酯激酶;enolase:烯醇化酶;hexokinase:己糖激酶;pyruvate kinase:丙酮酸酯;lactate dehydrogenase:乳酸脱氢酶;adenylate kinase:腺苷酸激酶;Insulin-like binding factors:胰岛素样结合因子;insulin like growth factor:胰岛素样生长因子;TGF:Transforming growth factor转化生长因子;Cyclin:细胞周期蛋白;differentiated chondrocyte:分化型软骨细胞ASK1 相互作用蛋白 1(ASK1-interacting protein-1,AIP1),也被称为 DAB2相互作用蛋白(DAB2-interacting protein,DAB2IP),是 Ras GTPase激活家族(Ras GTPase-activating proteinfamily)成员之一,高表达于血管内皮细胞并与细胞生长抑制及细胞凋亡密切相关[21,22]。另外,研究显示AIP1结合于VEGFR2及PI3K p85形成VEGFR2-PI3K复合物,抑制VEGFR2信号途径。AIP1作为VEGFR2介导的内源性抑制物而起作用,导致小鼠血管生成障碍。VEGFR2信号途径在血管形成中的关键作用己被研究所证明,通过调节VEGFR2的活性/活化可能是控制血管生成的重要机制[23]。作为细胞存活、生长和血管生成抑制剂,在各种人类肿瘤中,AIP1表达通常是下调的[21,24,25]。这些数据提示AIP1是一种肿瘤抑制基因。然而,高血糖和高胰岛素对AIP1表达的影响尚无研究证明,AIP1在糖尿病创面愈合分子机制中的作用尚未阐明。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),亦被称为血管渗透因子(vascular permeability factor,VPF),是内皮细胞特异性有丝分裂原,同时也是一种有效的促血管生成和增加血管通透性,趋化血管内皮细胞的诱导因子[26-29]。根据RNA剪切方式不同,VEGF存在9种亚型,其中VEGF165是重要的效应分子,也是主要的分泌形式,对内皮细胞的体外增殖和血管生成作用最强[30,31]。VEGF结合于血管内皮细胞的酪氨酸激酶受体VEGFR,可激活不同信号途径,发挥一系列生物学效应。目前,主要有3种VEGF受体(VEGF receptors,VEGFRs):VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3。其中 VEGFR-2 是 VEGF的主要受体,分布于血管内皮细胞、造血干细胞及巨噬细胞等。VEGFR-2的主要作用是调节血管内皮细胞的增殖、存活、迁移和通透性的改变[27.28]。研究证明VEGFR-2通过激活PI3K/Akt调节内皮细胞存活、迁移[32,33]。此外,VEGF结合于VEGFR-2,通过其下游PI3K/Akt通路激活内皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS),所生成的一氧化氮(NO)能够导致血管通透性的变化[34]。PI3K/Akt信号在细胞中广泛存在,此信号参与调节细胞增殖、凋亡、分化和葡萄糖转运等多种细胞功能,可被细胞因子等激活。Akt又称蛋白激酶B(protein kinase B,PKB),是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Akt是一种原癌基因和生长因子信号传导的下游主要效应基因,当PI3K被多种生长因子激活后,Akt显示出促进增长,抗凋亡作用[35]。研究表明,PI3K/Akt信号是HIF-1调节VEGF表达所必需的,是对生长因子刺激和癌基因激活的反应[36-40]。低氧环境下,PI3K/Akt信号通过激活核因子κB(NF-κB),其亚基结合于HIF-1α启动子,增加HIF-1α的mRNA表达[41]。有实验进一步报道,PI3K/Akt和NF-κB这两个信号途径能够相互促进,减少HIF-1α被pVHL降解,使得HIF-1α的表达增加[42,43]。另外,在肝细胞瘤细胞[44]、乳腺癌细胞[45]的实验研究中也证实了 PI3K/Akt可增加HIF-1α的活性。如前所述,AIP1结合于VEGFR2及PI3K p85形成VEGFR2-PI3K复合物,抑制VEGFR2信号途径。然而,在糖尿病创面愈合过程中,AIP1与PI3K/Akt/HIF-1信号途径之间的关系尚未阐明。综上所述,创面愈合过程中,HIF-1及其靶基因表达水平及活性与血管生成关系密切。葡萄糖及高血糖降低HIF-1及其靶基因表达水平及活性,其背后的分子机制尚未明确。糖尿病创面愈合过程中HIF-1及其靶基因表达及活性降低是愈合延迟的重要机制,是否与AIP1的变化及调节有关?目前,国内外对高糖/高胰岛素对AIP1表达的影响及其在糖尿病皮肤创伤修复过程中的表达并未见报道。AIP1是否作为一个重要分子参与调节这一病理过程?本实验自2013年10月至2014年12月,先以人脐静脉血管内皮细胞(humanumbilicalvein endothelial cell,HUVEC)作为研究对象,探讨高糖/高胰岛素对细胞中AIP1及PI3K/Akt/HIF-1信号通路的影响及二者之间的关系,然后以BALB/c糖尿病创面模型为研究对象,尝试采用含AIP1 shRNA的重组腺病毒进行创面局部注射,观察这一方法对创面愈合率,愈合组织中微血管密度,胶原沉积量,探索糖尿病创面愈合延迟的分子机制及靶向治疗手段,为临床治疗糖尿病难愈性创面提供新的思路。目的探讨AIP1与PI3K/Akt/HIF-1α信号途径之间的关系及其在糖尿病创面愈合分子机制中的作用,并尝试发现糖尿病创面基因治疗的新靶点。方法为模拟2型糖尿病的病理条件,采用低糖(LG,5.55 mmol/L glucose)、高糖(HG,30mmol/L glucose)、高胰岛素(LG/HI,1nmol/linsulin)及高糖+高胰岛素(HG/HI)对人脐静脉血管内皮细胞诱导。诱导后24小时,采用定量PCR和Western blot检测细胞中AIP1和PI3K/Akt/HIF-1α信号途径在mRNA和蛋白水平上的表达。采用RNA干扰下调AIP1的表达后,检测HIF-1α和VEGF基因表达的变化。建立糖尿病创面小鼠模型,分别在创面形成后的第0、4、7、10天检测创缘组织中AIP1、HIF-1αα和VEGF的表达。创面局部注射含AIP1 siRNA的重组慢病毒(Ad-AIPI-siRNA),于干预后第7天检测愈合组织中AIP1、HIF-1α和VEGF的表达。测量创面面积、计算创面愈合率,采用CD31和Masson染色以观察愈合组织中血管生成及胶原沉积情况。数据采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析,结果至少来自3次独立实验,用均数±标准差(x±s)表示。采用Student’s t检验进行两组比较,方差分析(ANOVA)进行组间比较,两两比较采用LSD方法。以P<0.05为差异有统计学意义。结果与低糖(5.5 mmol/lglucose,LG)相比,高糖促进AIP1表达,同时减少PI3K/Akt/HIF-1α信号途径的表达。胰岛素能够部分逆转高糖对目的基因表达的影响。下调AIP1的表达,HIF-1α和VEGF在mRNA和蛋白水平上的表达均显著增高。与健康小鼠创面相比,创面愈合过程中糖尿病小鼠创面组织中AIP1的表达量显著增加,同时HIF-1α和VEGF的表达均显著降低。糖尿病小鼠创面局部注射含AIP1 siRNA的重组慢病毒(Ad-AIP1-siRNA)第7天,AIP1表达下调,而HIF-1α和VEGF的表达均显著增加。第7、10和14天的创面愈合率显著增加,分别为58.84±2.2%、92.43±0.6%、99.39±0.2%,明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。Ad-siAIP1实验组CD31光密度值在第7、10天时高于Ad-siCtl组及空白对照组(第7天:0.82±0.07 vs.0.49±0.07 and 0.56±0.08,P=0.003;第10天:1.56±0.22 vs.1.24±0.10 and 1.11±0.08,P=0.02),差异有统计学意义。第7、10天时实验组胶原沉积高于Ad-siCtl组及空白对照组(第7天分别为1.14倍和1.28倍;第10天为1.45倍和1.40倍),差异有统计学意义(P<0.05)。结论高糖和高血糖促进AIP1的表达,AIP1可能在糖尿病创面愈合延迟的分子机制中起到重要作用。糖尿病创面愈合过程中受损的HIF-1α信号可能是AIP1调节的结果。下调创面组织中AIP1的表达,能够促进血管生成及胶原沉积,从而加速创面愈合。靶向AIP1基因治疗可能为糖尿病创面治疗带来新希望。