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目的:脂肪沉积与外周血管病变密切相关。脂肪组织与血管重塑和血管新生之间也存在紧密联系。但脂肪组织调节血管功能和成熟的分子机制并不十分清楚。本文将正常小鼠的脂肪组织移植到高脂饮食喂养(high-fat diet,HFD)的小鼠体内,探究脂肪组织对小鼠血流灌注和血管新生的影响,进一步分析移植后的糖代谢和炎症相关因子的变化,为肥胖、代谢相关性疾病以及外周动脉疾病等的治疗提供新的理论基础和潜在的治疗手段。 方法:1.高脂高糖小鼠喂养:高脂高糖饲料(45kcal%脂肪)喂养雄性C57/BL6J小鼠16周,定期测定并记录体重和血糖值。2.下肢缺血模型建立:将HFD小鼠腹腔注射麻醉剂(60mg/kg),脱毛消毒,在光学外科手术显微镜下,沿左下肢腹股沟皮肤作纵行切口,钝性分离股动脉,用5-0号线作两端结扎并剪断股动脉,建立左下肢缺血模型。3.脂肪组织移植:增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)小鼠,8周左右,雄性,取其腹股沟部的白色脂肪组织(white adipose tissue,WAT)和肩胛部的棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT),切割成50mg的组织块作为移植物,移植到HFD小鼠的缺血侧皮下股薄肌部位,并缝合消毒。控制每只小鼠接受移植的脂肪组织体积大小、重量相同。对照组小鼠在结扎股动脉手术后不移植脂肪组织,作为术后空白对照。由此,建立WAT组、BAT组和对照组(n=9/组)。为了进一步验证巨噬细胞在缺血血流灌注中的重要性,采用移植后的小鼠活体内注射巨噬细胞清除剂氯氟松(氯膦酸二钠脂质体),清除巨噬细胞后观察血流灌注情况。于是将HFD下肢缺血小鼠全部移植WAT,再随机分为两组,每组6只。在术后0天和4天分别腹腔注射氯膦酸二钠脂质体和安慰剂0.2mL/只。由此,建立WAT-inh组(氯膦酸二钠脂质体组)、WAT-sham组(安慰剂组)。4.活体成像检测:应用小动物活体成像仪(BRUKER Corporation,Billerica,MA,USA)将WAT和BAT移植后的小鼠,常规麻醉后,分别在3,7,10,14和21天在活体成像仪中扫描。拍摄荧光图像分两步,即GFP30s+白光0.175s。GFP采用480±10nm的激发波长和510±10nm的发射波长。5.应用点扫描高分辨激光多普勒成像仪moorLDI2-HIR(moor Instruments,Wilmington,Del)分别在结扎前和结扎移植后,3,7,10,14和21天,将小鼠麻醉、复温,相同环境下使用moorLDI2-HIR扫描小鼠俯卧位双下肢并记录、统计血流灌注恢复情况。6.免疫荧光检测:对小鼠内收肌和腓肠肌分别进行免疫荧光染色。脂肪移植后第21天,麻醉小鼠后,取小鼠下肢双侧腓肠肌和内收肌,将左右侧腓肠肌或内收肌切割后一部分包埋在包埋盒中,室温,4%多聚甲醛浸泡,缓冲液冲洗,再脱水透明,石蜡浸渍包埋,然后连续切片(6μm)。通过对石蜡切片进行免疫荧光染色检测血小板内皮黏附分子(PECAM-1,又称CD31)和血管周细胞的特异性标记物(NG-2),分析毛细血管密度,血管周围平滑肌细胞;通过对石蜡切片进行免疫荧光染色检测内收肌和腓肠肌内巨噬细胞总量(F4/80)的差异。7.实时定量RT-PCR检测:取小鼠内收肌和腓肠肌,提取RNA,实时定量荧光RT-PCR检测抗炎性M2型巨噬细胞标记物:CD206、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、纤连蛋白-1(fibronectin-1,Fn-1)和白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)的mRNA表达水平,以及促炎性M1型巨噬细胞标记物:CD11c、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6),肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)的mRNA表达水平,分析炎症相关因子含量的差异,巨噬细胞的浸润和极化;取小鼠内收肌和腓肠肌,提取RNA,实时定量荧光RT-PCR检测分泌因子血管生成素样蛋白-4(angiopoietin like protein-4,ANGPTL-4)、血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)和血小板衍生生长因子-B(platelet-derived growth factor-B,PDGF-B)的mRNA表达水平,分析促血管生长因子的差异,进一步分析其血管生成能力的差异。8.葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验:脂肪组织移植后第21天,WAT移植组、BAT移植组和对照组小鼠隔夜禁食约16小时,腹腔注射葡萄糖液(2g/kg);同样选择三组小鼠隔夜禁食约4小时,腹腔注射胰岛素(0.75U/kg),分别在0,30,60,90和120分钟时,用血糖仪检测尾静脉血的血糖值并记录,观察不同脂肪组织对小鼠葡萄糖的耐受量(glucosetolerance test,GTT)和胰岛素耐受量(insulin tolerance test,ITT)是否有影响。 结果:1.高脂饮食喂养的小鼠在移植了正常小鼠的WAT后,缺血下肢的血流恢复明显高于BAT组和对照组。WAT移植后增加了与新生血管相关的周细胞的募集,与血管成熟相关,但并不影响血管密度。2.WAT移植降低了HFD诱导的胰岛素抵抗作用,其中缺血肌肉M2型巨噬细胞数量显著增加,即CD206,TGF-β1和IL-10的mRNA表达水平增高,促进了缺血部位促血管生长因子的释放。WAT移植降低了缺血肌肉M1型巨噬细胞标记物,即IL-6,TNF-α,MCP-1和CD11c的mRNA表达水平明显降低。3.WAT移植增加了缺血性肌肉ANGPTL-4,VEGF-A和PDGF-B的mRNA表达。4.在ITT检测中,WAT移植组小鼠胰岛素耐受有明显改善;GTT检测中,BAT移植组小鼠葡萄糖耐受也明显受到改善。 结论:1.脂肪移植可以改善高脂小鼠缺血下肢血流灌注,促进血管成熟发展。2.脂肪组织移植改善胰岛素抵抗和葡萄糖耐受。3.研究脂肪移植的应用可能对肥胖、代谢相关性疾病以及外周动脉疾病等的治疗提供理论基础和潜在的治疗手段。