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柑橘绿霉菌又名指状青霉(Penicillium digitatum)是柑橘类水果采摘后储藏期间感染最为严重的病原菌,能引起果实腐烂,造成重大的经济损失。使用三唑类抗真菌药物能有效地抑制绿霉菌的生长,缓解病害。然而药物的长期使用造成了抗药性菌株的出现,使绿霉病的防治变得更加困难。本论文旨在探究指状青霉对农药咪酰胺的抗药性及其对柑橘类水果侵染的分子机制,为新型抗真菌剂的设计及绿霉病的防治提供理论基础。结合分子生物学与生物信息学方法,研究了指状青霉中一个新的甾醇调控元件结合蛋白SreA的功能,揭示了它与指状青霉抗药性之间的关系；同时运用RNA-seq技术对指状青霉经咪酰胺诱导前后的转录组进行了测定和分析,首次在转录水平上探究指状青霉的抗药性机制。本研究主要实验结果如下：1、在指状青霉的基因组中发现了一个与抗药性相关的甾醇调控原件结合蛋白(SREBP)编码基因。运用PCR技术、染色体步移技术、cDNA末端快速扩增技术克隆得到了该基因的全序列,命名为sreA。蛋白序列分析显示SreA蛋白的羧基端含有一个保守的DUF2014结构域,氨基端含有螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链结构域,这些结构域与甾醇调控元件结合蛋白(SREBP)家族转录因子的功能相关。2、通过根瘤农杆菌介导的转化系统成功构建了柑橘绿霉菌咪酰胺抗性菌株PdHS-F6 sreA基因缺失突变株(AsreA)及回补突变株(COsreA),对突变体的特性进行了研究。结果表明AsreA突变菌株对咪酰胺的敏感性降低,与HS-F6野生型菌株及回补菌株相比咪酰胺EC5o值明显下降。毒性测试实验显示AsreA菌株对柑橘类水果的毒性降低,而sreA基因的回补可以很大程度上恢复菌株的毒性。3、荧光定量PCR结果表明在AsreA cyp51基因的转录水平发生明显下降。AsreA突变菌株相对于HS-F6野生型菌株三种cyp51基因cyp51A/B/C基因的相对表达量分别为0.02、0.29、0.47。证明sreA基因的缺失使指状青霉cyp51基因的转录受到了抑制,其编码蛋白参与指状青霉cyp51基因的转录调控。同时探究了sreA基因在指状青霉cyp51基因对咪酰胺转录应答方面发挥的作用。HS-F6野生型菌株经咪酰胺药物诱导后药物靶标酶cyp51A及cyp51B的表达发生上调,而在AsreA突变菌株中咪酰胺没有诱导cyp51A及cyp51B基因的上调。这说明SreA蛋白是一个重要的转录调控因子,参与cyp51基因的转录调控。综上所述,sreA基因与指状青霉对农药咪酰胺的抗性、对柑橘类水果的侵染毒力以及cyp51基因的调控有关。此蛋白可作为新型杀菌剂的靶标,对真菌抗药性机制的研究及新药的设计具有重要的意义。4、在转录组水平上进一步探究了柑橘绿霉菌咪酰胺高抗菌株HS-F6的抗药性机制。提取指状青霉抗性菌株(HS-F6)及敏感菌株(HS-E3)咪酰胺处理前后的总RNA,将样品送至公司(北京诺禾致源生物信息有限公司)进行转录组测序。对测序的数据进行分析找出两种菌株在基因表达上的差异。筛选出了可能与HS-F6抗性及咪酰胺药物应答相关的基因。结果显示,咪酰胺胁迫处理前,菌株HS-F6与HS-E3在基因转录水平上有显著的差异,共有1520个差异基因。将咪酰胺处理前后的转录组数据进行对比,结果显示敏感菌株HS-E3中存在224个与咪酰胺应答相关的基因,其中有154个基因表达下调,70个基因表达上调；而在抗性菌株HS-F6中有1100个应答基因,其中有698个基因表达下调,402个基因表达上调。两种菌株咪酰胺胁迫处理后共有的差异表达基因有82个,HS-E3特有的差异表达基因有141个,HS-F6特有的差异表达基因有1018个。5、通过GO及KEGG聚类分析对差异基因进行筛选,找出了多个与抗药性相关的药物转运蛋白编码基因。包括14个MFS (Major Facilitator Superfamily)家族的转运蛋白；8个ABC家族的转运蛋白(ATP-binding cassette transporter)及3个MATE (multidrug and toxic compound extrusion family)家族的转运蛋白。运用荧光定量PCR对其中表达变化较大的13个药泵蛋白编码基因进行了表达验证。结果显示HS-F6菌株用咪酰胺胁迫处理6小时后,筛选出的7个MFS家族、3个ABC家族及3个MATE家族的转运蛋白中除MFS5 (PDIG 51830m.01)基因的表达没有被检测到以外,其他基因的表达情况与转录组测序结果基本一致。进一步证明了转录组测序结果的可信性及可重复性,也说明这些药泵蛋白与柑橘绿霉菌对咪酰胺的药物应答密切相关。