随着抗生素的过度使用,一方面导致食品中的药物残留问题间接危害人们的身体健康；另一方面又给病原菌造成巨大选择压力,导致出现许多抗生素抗性的菌株,直接威胁人们的身体健康。抗菌肽是生物体在进化过程中最早产生的免疫活性分子之一,是动物先天性免疫应答中极其古老的成分,在动物先天性防御体系中占据重要地位。抗菌肽分子由20～100个氨基酸残基组成,广泛存在于动植物与微生物中,具有广谱抗菌、不易产生耐药性的优点。抗菌肽除了具有抗细菌、抗病毒、抗肿瘤、抗寄生虫的功能,还具有免疫调节、参与细胞信号传导、调节细胞增殖等功能。因此,抗菌肽在临床医疗中以及动物保健中具有广阔的应用前景。然而天然抗菌肽并非完美无缺,与抗生素相比,抗菌谱相对较窄、合成成本较高、部分对病原微生物有杀灭活性的同时对真核细胞存在溶血作用。对抗菌肽分子进行设计与改造,开发出高抗菌活性低溶血性的抗菌肽意义重大。尽管抗菌肽的分子设计还存在许多困难,但是运用现代生物信息学方法,计算抗菌肽的结构参数,分析这些结构参数对抗菌肽活性的影响,进而筛选出更优秀的抗菌肽仍然是可能的。运用现代生物信息学工具,将不同抗菌肽分子的核心序列进行杂合,就是获得更优秀的抗菌肽分子的最为有效的方法之一本研究选取牛乳铁蛋白肽与Magainin-2勺核心功能序列,进行不同片段间的杂合,得到6条α-螺旋型杂合抗菌肽。利用众多的生物信息学工具,计算它们的理化结构参数,比较杂合抗菌肽的净正电荷数多少、疏水力大小以及两亲性强弱,分析它们的二级结构,比较它们的螺旋度,绘制螺旋轮图谱验分析杂合肽的两亲性与电荷分布特征。将杂合肽的氨基酸序列送往公司合成后,检测合成肽最小抑菌浓度以及溶血性。结果显示,合成杂合抗菌肽LFM-3的抑菌效果最佳,对革兰阳性的金黄色葡萄球菌Cowan I的MIC为16μg/mL,对革兰阴性的致病性大肠杆菌K88的MIC为32μg/mL,但高浓度的LFM-3对鸡血红细胞有轻微的溶血性。根据杂合抗菌肽LFM-3的氨基酸序列,选用酵母偏爱密码子,确定目的基因的碱基序列,对其进行必要设计后交由公司合成。Xba Ⅰ与Xho Ⅰ双酶切亚克隆到穿梭载体pPICZaA中,转化大肠杆菌DH5a,挑取阳性克隆菌进行放大培养,大量抽提纯化重组质粒。将重组质粒用限制性内切酶Sac I单酶切线性化后,电击转化入表达宿主巴斯德毕赤酵母SMD1168中,待阳性转化子生长到直径约为2mmm时,依次点种至含Zeocin200μg/mL,500μg/mL、1000μg/mL的YPDS选择平板上,以在最高浓度Zeocin上仍能正常生长的转化子为高拷贝转化菌株。对阳性重组酵母进行甲醇诱导表达后,初步检测重组表达上清的抗菌活性,结果显示,表达上清对金黄色葡萄球菌Cowan I与大肠杆菌K88的抑菌圈直径分别达到20mm与17mm.而作为阴性对照的空载体表达上清对金黄色葡萄球菌Cowan I与大肠杆菌K88均没有抑菌圈出现。对重组抗菌肽的震荡培养表达条件进行摸索,结果显示,在诱导温度为28℃、诱导甲醇浓度为0.5%以及诱导起始pH6.0的条件下,诱导表达72h后,重组抗菌肽得到了最大程度的表达。在重组表达抗菌肽的纯化过程中,作了多种尝试,包括对表达上清进行透析浓缩、尝试不同的结合缓冲液以及不同的洗脱缓冲液、尝试不同的色谱介质等等,但检测结果始终显示杂合肽LFM-3未能与介质结合。推测原因,可能是抗菌肽的单位活性较高但表达量过少以及其他未知原因。