肿瘤的发生发展是个多因素参与的过程,其中机体的免疫系统在肿瘤的发病机制中占有重要的地位。因而机体免疫功能状态与肿瘤的关系一直是人们试图阐明的重要问题,在肿瘤细胞在与免疫系统的较量中,肿瘤细胞可以通过多种途径来逃避机体的免疫识别与攻击。肿瘤相关的免疫抑制细胞和免疫抑制因子是肿瘤免疫逃逸的主要机制。早在30年代就提出了机体内可能存在具有抑制功能的免疫细胞,这种细胞可通过抑制免疫应答从而促进肿瘤生长,但是由于这群细胞表型及功能的不清楚,这一观点一直受到免疫学家的争议,直到1995年日本学者Sakaguchi等发现CD4+CD25+T组分的T细胞转到裸鼠体内会引发多种自身免疫性疾病,随后体外研究进一步证实CD4+CD25+Treg细胞具有低反应性和免疫抑制功能。在保持自身耐受和免疫稳定的同时,也以某种机制抑制着免疫系统对肿瘤细胞的免疫应答,因此,CD4+CD25+Treg细胞不但可能在肿瘤逃逸、促进肿瘤的生长中发挥作用,也可能是肿瘤疫苗和免疫增强剂难以奏效的因为。　　 中医理论关于肿瘤的发生发展与正气内虚相关的理论与现代医学关于肿瘤与免疫的理论不谋而合,多年来的研究证明扶正中药发挥抗肿瘤作用主要机制是对荷瘤机体免疫功能的调节,而对于扶正中药是否对肿瘤免疫耐受具有调节作用,目前尚不明了,因此本研究以我国传统补益类中药蛹虫草为代表,以与肿瘤免疫耐受密切相关的CD4+CD25+Treg细胞为切入点分别从动物实验和临床研究两个方面观察蛹虫草对荷瘤机体免疫逃逸细胞CD4+CD25+Treg的调节作用,探讨扶正中药治疗肿瘤的具体免疫调节机制,主要进行了以下四个方面的研究:　　 1蛹虫草对小鼠Lewis肺癌肿瘤生长与转移的作用观察　　 以小鼠Lewis肺癌细胞为模型分别从体内体外观察蛹虫草对肿瘤生长的影响,体外实验以MTT法检测蛹虫草对Lewis肺癌细胞增殖的影响:体内实验建立Lewis肺癌移植肿瘤模型以肿瘤体积变化、抑瘤率、肺重、肺转移灶数目评价蛹虫草的作用,体外实验结果表明蛹虫草不具有直接抑制Lewis肺癌细胞生长的作用。体内实验结果显示蛹虫草治疗组小鼠肿瘤生长缓慢,抑制率为28.6％,与模型对照组相比有差异(P<0.05)。蛹虫草治疗组荷瘤鼠双肺重量低于对照组,肺转移灶计数明显少于模型组(P<0.05),说明蛹虫草对Lewis肺癌移植肿瘤的生长及转移具有一定的抑制作用,但这种抑制作用可能与直接的细胞毒作用无关。　　 2 Lewis肺癌荷瘤小鼠CD4+CD25+Treg与肿瘤生长的关系研究　　 分别采用流式细胞仪、荧光定量RT-PCR于不同时间检测Lewis肺癌荷瘤小鼠脾脏和肿瘤引流淋巴结中免疫抑制细胞:CD4+CD25+Toxp3+、MDSCs、CD8+CD28-Ts的表达。研究结果显示随着荷瘤时间的延长,荷瘤小鼠脾脏CD4+CD25+Toxp3+、MDSCs比例均显著增加,同时在肿瘤引流淋巴结CD4+CD25+Foxp3+数量也显著增加,而MDSCs在肿瘤引流淋巴结的比例较小,没有明显的变化。荷瘤小鼠CD8+CD28-Ts没有明显的变化,检测荷瘤小鼠肺转移灶组织CD4+CD25+的特异性标志Foxp3的mRNA的表达,结果显示转移灶组织浸润大量CD4+CD25+Foxp3+,这提示CD4+CD25+Foxp3+与肿瘤的生长和转移密切相关,肿瘤生长过程中通过某种机制刺激体内CD4+CD25+Foxp3+的生成,增殖活化后的CD4+CD25+Treg细胞可通过抑制效应细胞的功能,干扰效应细胞对肿瘤细胞的免疫应答,成为肿瘤细胞逃避免疫杀伤的机制之一,介导肿瘤生长及转移。　　 3蛹虫草对Lewis肺癌荷瘤小鼠CD4+CD25+Treg及免疫监视功能的影响　　 研究结果显示应用蛹虫草可使Lewis肺癌小鼠脾脏、引流淋巴结中CD4+CD25+Treg的数量下降、肿瘤转移灶中Foxp3 mRNA的表达水平降低,因此,应用蛹虫草治疗使荷瘤鼠的肿瘤生长速度延缓、转移灶数目减少,因为之一是通过降低CD4+CD25+Treg细胞的数量,削弱CD4+CD25+Treg细胞对CD4+、CD8+T细胞等效应细胞的抑制功能,使免疫效应细胞能够正常发挥对肿瘤细胞的识别和杀伤功能,抑制肿瘤的生长。　　 4蛹虫草减少Lewis肺癌荷瘤小鼠CD4+CD25+Treg机制的研究　　 IL-10、TGF-β不仅是CD4+CD25+T发挥免疫效应的抑制因子,同时与趋化因子CCL22一起被认为是肿瘤源性诱导CD4+CD25+T产生及募集到肿瘤组织形成免疫赦免区域的关键因素。采用Elisa、RT-PCR分别检测荷瘤小鼠血清、转移灶组织中IL-10、TGF-β、CCL22、及效应细胞因子IFN-γ表达。结果显示:荷瘤小鼠外周血TGF-β、IL-10、CCL22均较正常组升高,RT-PCR也得到一致的结果,说明肿瘤生长过程中可分泌免疫抑制因子,诱导CD4+CD25+T的扩增,介导肿瘤免疫逃逸,蛹虫草可同时减少荷瘤小鼠外周血、肿瘤转移灶组织TGF-β、CCL22的表达水平,而对IL-10的变化无显著作用,同时效应性性细胞因子IFN-γ表达增加,这提示我们蛹虫草抑制Lewis肺癌的生长转移灶可能是通过降低与CD4+CD25+T生成、抑制功能相关因子,减少CD4+CD25+Treg数量,从而恢复机体的抗肿瘤免疫功能。　　 5晚期非小细胞肺癌患者外周血中CD4+CD25+Treg检测的临床意义　　 选择46例非小细胞肺癌患者(NSCLC)患者,并以30例健康人作对照,以CD4+CD25highCD127lowT作为调节性T细胞的标志,联合CD8+CD28Ts抑制性T细胞观察NSCLC患者淋巴细胞亚群的变化,探讨其与临床特征的关系,结果显示NSCLC患者CD3+、CD4+、CD8+T、NK细胞均较正常对照组下降,但除了CD3+T细胞比例下降有显著差异外,其余均无显著性差异,CD4+CD25highCD127low、CD8+CD28-Ts与对照组相比显著升高,且与患者临床分期、卡氏评分呈正相关,越是晚期其比例越高,说明晚期NSCLC患者免疫功能低下,处于抑制状态。因此单纯以CD3+、CD4+、CD8+T、NK细胞不能完全反映肿瘤患者的免疫功能状态,联合CD4+CD25highCD127low CD8+CD28-Ts监测,有助于全面了解患者免疫功能状态。　　 6蛹虫草对晚期非小细胞肺癌患者CD4+CD25+Treg及免疫状态影响　　 化疗的非选择性损伤在杀伤肿瘤细胞的同时,也可对机体免疫系统造成损伤,使得免疫功能低下,进一步加重患者免疫抑制状态,为观察蛹虫草的免疫保护作用,采用随机双盲对照方法,将符合纳入标准的36例NSCLC患者随机分为蛹虫草联合化疗组和单纯化疗组,观察患者免疫功能的变化,结果显示,化疗组CD3+、CD4+、CD8+T、NK细胞均显著减低,而CD4+CD25highCD127lowCD8+TCD28-Ts比例减低无显著意义,说明化疗可使免疫系统功能功能进一步低下。蛹虫草联合化疗组可提高淋巴细胞亚群的比例,同时发现CD4+CD25highCD127low、CD8+TCD28-Ts下降,生存质量优于化疗组。　　 结论　　 综上本实验得出以下结论:　　 1 Leiw肺癌荷瘤小鼠CD4+CD25+Treg随着肿瘤的生长进行性增加,说明肿瘤生长过程中释放某些因子,刺激CD4+CD25+Treg的增殖活化,抑制有效抗肿瘤免疫应答,参与肿瘤生长转移。　　 2扶正中药蛹虫草对可抑制小鼠Lawis肺癌肿瘤生长与转移,对体外培养的Lewis细胞无明显抑制作用。蛹虫草可降低荷瘤体内升高的免疫抑制因子TGF-β、CCL22同时升高效应细胞因子IFN-γ这可能是其下调荷瘤体内CD4+CD25+Treg从而部分恢复机体抗肿瘤免疫功能,延缓肿瘤生长,抑制转移的主要机制。　　 3 NSCLC患者外周血CD4+CD25highCD127low、CD8+CD28-Ts显著高于正常健康对照,且与患者临床分期、卡氏评分相关,可作为肿瘤患者免疫状态评估指标　　 4扶正中药蛹虫草对化疗的免疫损伤具有保护作用,同时可减低抑制性T细胞的比例,改善患者免疫状态及生活质量,进一步说明扶正中药在肿瘤综合治疗中具有重要的地位。