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目的本课题拟从体内外抗病毒、解热、抗内毒素损伤、抗纤维化等方面考察精制清开灵（暂定名）注射液用于治疗中医温病肺热证之上呼吸道感染、急性肺部感染的主要药效学作用及部分作用机制。实验方法1、实验分组及给药剂量大白鼠给药剂量如下:精制清开灵大剂量组:2.78g生药/kg、中剂量组:1.39 g生药/kg、小剂量组:0.70 g生药/kg;分别相当于临床给药剂量的16、8和4倍。家兔给药剂量如下:精制清开灵大剂量组:1.20g生药/kg、中剂量组:0.60g生药/kg、小剂量组:0.30 g生药/kg;分别相当于临床给药剂量的6.9、3.5和1.7倍。阳性对照组:清开灵注射液,给药剂量相当于实验组的中剂量。正常和模型对照组给等量生理盐水。2、实验方法及检测指标2.1精制清开灵注射液体外抗SARS病毒作用2.1.1对SARS-COV-P11、SARS-COV-8的预防作用VER0E6细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板,37℃5%CO2孵箱培养24小时,细胞培养至单层,弃掉培养液,加入不同浓度的精制清开灵注射液,药物选用对细胞的最大无毒浓度（TD0）2倍稀释7个浓度即1:41:256,阳性对照药物更昔洛韦为2倍稀释10个浓度即6000μg/ml11.7μg/ml,将稀释的药物分别加入细胞孔内,每浓度3孔,置37℃5%CO2吸附2小时后,弃掉药液,分别加入100TCID50CO2培养箱57天,逐日在倒置显微镜下观察病毒CPE,以病毒对照出现+++——++++时结束实验,用Reed-Muench法,计算药物的半数有效浓度(IC50)和最小有效浓度（MIC）及治疗指数（TI）判断药效,试验重复三次。2.1.2对SARS-COV-P11、SARS-COV-8的抑制作用细胞培养至单层后,分别加入100TCID50的2株冠状病毒液,置37℃5%CO2吸附2小时后,弃掉药液,加入不同浓度的精制清开灵注射液和更昔洛韦,药物稀释浓度及以下步骤同上。2.1.3对SARS-COV-P11、SARS-COV-8的灭活作用细胞培养至单层后,加入精制清开灵注射液不同浓度和病毒液的中和液（室温中和24小时）,以下步骤同上。2.2精制清开灵注射液解热作用选用体重1.8—2.2kg、体温38.8-39.5℃之间的家兔50只,雌雄各半,共分为五组,实验前给药一次,均采用耳缘静脉给药。实验当日,测量动物正常体温两次,取其均数为动物基础体温,然后由耳缘静脉给动物注入细菌内毒素溶液100eu/kg（2.0ml/kg）,同时给药,之后分别于1、2、3、4、6、8、12小时测量动物体温。计算不同时间点动物体温升高。2.3精制清开灵注射液对家兔病毒性肺炎的作用家兔选择同上,共分为6组,每组10只。实验前给药一次,实验当日,测量动物正常体温两次,取其均数为动物基础体温,然后,除正常动物对照组外,其它各组动物经颈部环状软骨注入气管仙台病毒培养液进行造模,剂量为0.6ml/kg,同时给药一次,然后分别于造模后2、4、6、8、12小时测量动物体温一次,第二天、第三天分别给药一次,并继续测量动物体温三次,间隔4小时,计算不同时间点动物体温升高。第四天处死动物,取肺脏进行病理检查（10%甲醛固定,石蜡包埋,HE染色）。2.4精制清开灵注射液对内毒素致大鼠脏器损伤的保护作用选用SD大白鼠,体重280±20克,雌雄各半,按体重均匀分为6组,每组12只。实验前给药一次,均采用尾静脉给药,实验当日,除正常组动物外,其余各组动物分别经尾静脉注入内毒素500eu/kg（200eu/ml,2.5ml/kg）,同时给药一次,正常对照组动物给予等量生理盐水。实验第2、3天重复给药一次,第4天取静脉血进行血清SOD和MDA测定,并处死动物取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺进行病理检查（10%甲醛固定,石蜡包埋,HE染色）。2.5精制清开灵对博莱霉素致大鼠肺损伤的保护作用动物选择同上,实验当日,用戊巴比妥钠麻醉动物,采用手术方法,由气管给各实验组动物注入注射用盐酸博莱霉素5mg/kg（0.5%,1.0ml/kg）,造成肺损伤模型,空白组动物注射等量生理盐水。实验第2天将各实验组造模后仍存活动物分为5组,空白组动物正常饲养,各实验组动物连续给药3周,末次给药后第二天,处死动物,取肺脏,10%甲醛固定,石蜡包埋,分别HE和VG染色,进行病理检查。2.6统计学方法实验结果用均数±标准差（（?）±s）表示,采用SPSS3.0软件进行单因素随机方差分析或多组T检验和非参数检验。实验结果1、抗病毒作用CPE法测定,该药具有一定的抗SARS病毒作用,其对SARS-COV-P11、SARS-COV-8的预防、抑制和灭活药物半数有效浓度(IC50)分别为32.5mg生药/ml、65.0mg生药/ml和32.5mg,最小有效浓度（MIC）分别为16.3mg生药/ml、32.5mg生药/ml和16.3mg生药/ml,治疗指数（TI）分别为4、2和4。2、对内毒素致家兔体温升高的抑制作用造模后各组动物体温1小时后明显升高,之后给药组动物体温开始下降,而模型组动物体温继续升高,于3小时达到高峰,所有动物体温于造模后6小时基本恢复正常。实验期间各给药组动物体温升高均低于模型组,3小时时,给药小剂量组动物体温升高较模型组明显降低（P＜0.05）。虽然各给药组动物6小时体温反应指数与模型组比较统计学无明显差异,但其降低趋势明显。以上试验结果提示精制清开灵注射液具有明显的解热作用。3、对病毒性家兔肺炎模型的治疗作用3.1对动物体温的影响:动物给予病毒培养液造模后,体温开始升高,于8小时达到高峰,除中剂量组和小剂量组动物分别于8小时和12小时两个时间点,其体温升高高于模型组外（P＞0.05）,其它时间段各给药组动物体温升高均低于模型组,各给药组动物体温于造模后12小时基本恢复正常,而造模组动物体温仍有较明显的升高（小剂量组、中级两组P＜0.05）。49小时体温反应指数与模型组比较无显著差异,但有明显的降低趋势。3.2对肺脏组织形态学的影响:造模组家兔肺脏病变显著,可见肺泡局部融合间质充血,肺泡内有散在的红细胞吞噬细胞淋巴细胞浸润,局部红细胞及浆液性物渗出,细小及终末支气管可见上皮细胞脱落,黏膜灶壮淋巴细胞浸润,内有含铁红素沉淀及少许核破碎片,模型组10只动物的病理改变均在Ⅱ级以上,其中7只为Ⅲ级。阳性组动物较模型组动物肺脏损伤均有所恢复,阳性组10只动物有4只恢复到Ⅰ级,细小及终末支气管损伤减轻,肺泡内红细胞、吞噬细胞减少,淋巴细胞减少,淋巴细胞浸润减轻,管道通畅,无严重的结构破坏。用药大、中、小剂量组动物肺脏损伤均有所恢复,其中大剂量组有一只动物完全恢复正常（0级）,6只动物明显恢复（Ⅰ级）,中、小剂量组动物恢复不及大剂量组动物,分别有5只和3只明显恢复,但仍分别有1只和2只动物无明显改变（Ⅲ级）。4、对内毒素致多脏器损伤的保护作用4.1对血清SOD和MDA的影响:模型组和正常组动物血清SOD含量无明显差异,而大剂量组和中剂量组动物血清SOD含量较模型组和正常组均有明显提高（P＜0.01）,说明精制清开灵对血清SOD含量有较好的促进作用;虽然各给药组动物血清MDA含量与模型组动物比较无显著差异,但是,均有一定不同程度的降低,说明该药对MDA的生成有一定的抑制作用。4.2对主要脏器的影响肺:模型组动物取材时可见一半以上的肺脏明显充血增大。镜下可见肺泡明显扩张融合,细支气管结构破坏严重,上皮层与黏膜层有分离现象。腔内有大量渗出物及脱落的上皮细胞,红细胞及巨噬细胞。间质毛细血管扩张充血,可见大量巨噬细胞浸润,病理分级6只为Ⅲ级,6只为Ⅱ级。阳性组均恢复至Ⅱ级以下;大剂量组效果最为显著;中剂量、小剂量组也有恢复,与模型组相比无差异。肝:与对照组相比,模型组动物肝脏损坏最为严重,镜下可见肝小叶结构紊乱,肝窦及中央静脉内有大量红细胞沉积,可见肝细胞点状坏死,大量肝细胞水肿变性,胞浆淡染,间质内可见炎细胞浸润,偶可见再生的肝细胞,病理评级均达到Ⅲ级。阳性组和大剂量组恢复较好,各有1只为Ⅱ级,其余均在Ⅰ级以下,阳性组有5只,大剂量组有4只完全恢复。与模型组相比,中剂量和小剂量组也有恢复,但不如大剂量组效果显著。心:与肝、肺、肾相比,模型组动物的心肌病理改变较轻。但与对照组相比,仍有显著差异。镜下可见心肌纤维化肿胀,排列紧密淡染,间质水肿毛细血管扩张充血,有淋巴细胞和单核细胞浸润。阳性组与大剂量组均恢复到Ⅰ级以下。中剂量和小剂量组与模型组相比,无明显改善。肾:大体观察:模型组动物肾脏明显水肿增大,有的可见黄白斑点。镜下可见肾小球大小不一,肾小管上皮细胞水肿,管内可见大量蛋白渗出物,部分肾小球纤维化,肾小囊壁增厚,肾小管萎缩消失,部分肾小管代偿性扩张,间质毛细血管扩张充血,可见炎细胞浸润,病理分级8只为Ⅲ级,4只为Ⅱ级。阳性组均恢复到0级和Ⅰ级;大剂量组仅有2只为Ⅱ级,5只为0级,与模型组相比效果显著;中剂量和小剂量组有恢复,但效果不显著。肾上腺和脾脏未见明显改变。5、抗肺纤维化作用肉眼所见:各造模组动物肺脏体积增大,表面灰白色,与正常组比较肺脏指数明显增高,各给药组动物肺脏指数与模型组比较无明显差异造模组动物肺脏病变显著,肺实质结构紊乱,肺泡局部融合,肺泡内有散在的红细胞沉积、炎细胞浸润,细小及终末支气管内可见脱落的上皮细胞、吞噬细胞,管内有大量含铁血黄素沉积,间质充血水肿,肺间隔增宽,模型组8只动物的病理改变均在Ⅱ级以上,其中5只为Ⅲ级。用药组和阳性组动物的肺脏病理改变均有不同程度的恢复。阳性组有两只动物达到Ⅰ级,细小及终末支气管损伤恢复,结构尚算完整,管内渗出物及红细胞减少,肺间质纤维化减轻;用药大剂量组动物肺脏恢复明显,2只动物肺泡炎症恢复正常,2只Ⅰ级,有5只动物肺间质纤维化达Ⅰ级;用药中、小剂量组肺脏恢复不很明显,分别有2只和3只仍被评为Ⅲ级。结论综合以上实验结果精制清开灵注射液具有如下药效学作用。1、抗病毒作用:与更昔洛韦相比较,精制清开灵体外对SARS病毒的预防、抑制和灭活作用不明显,其治疗指数为4、2、4（更昔洛韦为256）,但是,作为中药复方制剂,其在一定药物浓度下亦表现出体外对SARS病毒的预防、抑制和灭活作用,提示该药对SARS病毒有一定的抑制作用。2、解热作用:对内毒素致家兔体温升高有明显的抑制作用,能明显降低动物体温升高,动物体温反应指数也有明显的降低趋势;对病毒性肺炎家兔体温升高和体温反应指数也有一定的抑制作用。3、抗内毒素作用:对内毒素致多脏器损伤具有明显的保护作用,可明显提高动物血清SOD浓度,对内毒素所引起的大鼠心、肝、肺、肾脏器损伤有很好的保护作用。4、对家兔肺炎模型的治疗作用:对仙台病毒导致的肺泡炎细胞浸润,细支气管炎细胞浸润、红细胞沉积,间质炎细胞浸润、增宽等病理损伤均有明显的保护作用。5、抗肺纤维化作用:本实验采用博莱霉素建立了大鼠肺脏炎性损伤和严重的肺间质增生性损伤模型,并施以精制清开灵治疗,结果显示该药对大鼠肺脏炎性浸润及间质纤维化损伤均有一定的对抗作用。