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第一部分 miR-452在肝癌肿瘤干细胞样细胞和肝癌组织中的表达及其临床病理意义目的既往的文献报道中,miR-452在恶性肿瘤中的表达模式不尽一致。同时,miR-452对肝癌细胞尤其是肝癌肿瘤干细胞的调节作用尚不明确。本研究旨在明确miR-452在肝癌肿瘤干细胞样细胞和组织中的表达模式,并进一步统计分析miR-452表达水平与肝癌患者临床病理因素以及预后的关系。方法本部分我们利用无血清培养法联合阿霉素和索拉菲尼,连续传代培养筛得耐药的肝癌细胞球,接着对上述获得的肝癌细胞进行了干性鉴定。进一步利用qPCR方法检测在富集的肝癌肿瘤干细胞样细胞中miR-452的表达水平。同时利用原位杂交技术检测肝癌临床样本中miR-452的表达水平。结果QPCR结果显示耐药肝癌细胞球细胞干性相关基因表达明显升高。流式检测显示CD44、CD133、CD90、EpCAM等肝癌肿瘤干细胞标记分子比例明显升高。皮下成瘤能力也明显增强。因此,利用无血清培养基联合阿霉素和索拉菲尼筛选获得的耐药肝癌细胞悬浮球细胞具有肿瘤干细胞的特性。进一步的原位杂交结果显示,肝癌组织的miR-452表达水平较癌旁组织明显升高。并且生存分析结果显示miR-452的表达水平与肝癌术后患者的总体生存率成显著负相关。结论本研究证实了利用无血清培养法联合阿霉素和索拉菲尼可以筛选获得肿瘤干细胞样细胞。并且miR-452在肿瘤干细胞样细胞中表达明显高于贴壁分化细胞。miR-452在肝癌细胞系和肝癌组织中表达水平明显升高。肝癌组织中miR-452的表达水平与肝癌患者的总体生存率呈明显负相关,明确了miR-452对于临床肝癌术后患者的预后判断价值。第二部分 MiR-452对肝癌肿瘤干细胞样特性的作用及其分子机制研究目的第一部分研究结果提示,miR-452很可能在肝癌的发生发展过程中起着重要的生物学作用,并且miR-452很有可能通过调控肝癌细胞肿瘤干细胞样特性来促进肝癌的发生发展。方法本部分中,我们利用慢病毒过表达和敲低了miR-452,然后分别检测了肝癌细胞肿瘤干细胞样相关特性,包括耐药能力、干性相关基因的表达、自我更新能力、体内成瘤能力以及转移能力等。接着通过生物信息学软件预测并利用双荧光报告实验和western blot以及补救实验验证miR-452的直接靶基因。TOPFlash和FOPFlash双荧光报告实验检测Wnt/β-catenin信号通路的活性。进一步的荧光共定位和免疫共沉淀实验验证SOX7可以与β-catenin和TCF4之间的相互作用。结果过表达和敲低实验证实,miR-452可以明显促进肝癌细胞肿瘤干细胞样特性。双荧光报告实验和western blot证实了Sox7为miR-452的直接靶基因。TOPFlash和FOPFlash双荧光报告实验证实SOX7可以剂量依赖性的抑制Wnt/p-catenin信号通路的活性。进一步的荧光共定位和免疫共沉淀实验也证实了SOX7可以与β-catenin和TCF4发生直接的相互作用。结论MiR-452可以明显促进肝癌细胞的耐药性、干性相关基因表达、成球能力、体外迁移和侵袭能力、体内的皮下成瘤能力和转移能力等肿瘤干细胞相关特性。在肝癌细胞中,Sox7是miR-452的直接作用靶基因。SOX7在肝癌组织中的表达水平明显低于癌旁组织；并且在肝癌组织中SOX7低表达的肝癌患者预后明显较差,是肝癌患者术后长期生存的一个独立危险因素。研究发现,MiR-452通过直接抑制Sox7基因从而活化了Wnt/β-catenin信号通路,引起β-catenin依赖的重编程,最终促进了肝癌细胞肿瘤干细胞样特性生长。