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MicroRNAs(miRNAs)是一类能作为转录后调控因子的非编码小RNA分子,可以调控基因表达,在生物体中发挥着许多非常重要的作用。南京大学张辰宇教授在2012年首次报道了跨物种miRNA的相互作用,发现植物miRNA能像哺乳动物自身产生的miRNA 一样调控哺乳动物的基因表达。此后,越来越多的研究证实了外源的miRNA可以跨物种调控基因的表达。猪作为重要的农业经济动物和生物医学研究模型,其主要食物来源为玉米和大豆,是研究外源植物miRNA和哺乳动物之间跨物种交流的理想动物模型。本试验以猪为研究对象,从NCBI数据库中下载部分有关猪small RNA高通量测序的数据集,通过生物信息学分析其中所含的玉米miRNA序列信息;动物试验中,在给猪饲喂新鲜玉米后不同时间点采集血液及组织样品,采用stem-loop RT-PCR检测猪血液和组织中玉米miRNA的浓度,并使用TA克隆、Sanger测序等方法进一步确定PCR产物的特异性;在确认玉米miRNA可被猪吸收入血后,采用TargetScan、NCBI Blast和RNAhybrid等软件预测玉米miRNA在猪体内潜在的靶基因,并利用Mir-Trap和双荧光素酶报告系统等方法来验证所预测靶基因与玉米miRNA的靶标关系。试验结果如下:1从NCBI数据库中共下载了 25个猪的small RNA测序数据集,用生物信息学方法进行过滤和筛选后,发现上述测序数据中含有植物miRNA,其中MIR168a和MIR166a丰度最高,分别占总植物源miRNA的58.51%和37.24%(取25个样本的平均值)。2给猪饲喂新鲜玉米后收集不同时间点血液,分离血清后提取血清中总RNA,采用stem-loop RT-PCR的方法检测猪血清中玉米miRNA,结果显示猪采食新鲜玉米后,5种玉米miRNA在猪的血清中的含量升高,并在6h或12h达到峰值。3用超高速离心的方法从猪血清中分离外泌体(exosomes),并使用stem-loop RT-PCR检测其中所含的玉米miRNA,结果显示猪血清exosomes中含有玉米miRNA,其玉米miRNA含量占血清中玉米miRNA总量的58.2%左右。4给猪连续饲喂新鲜玉米7 d后采集心、肝、脾、肺、肾、大脑和眼肌,提取其中总RNA,采用stem-loop RT-PCR的方法检测猪组织中玉米miRNA,结果显示与对照组相比zma-miR164a-5p含量在心、眼肌、脾、肾中显著升高。5 用 TargetScan、NCBI Blast 和 RNAhybrid 等方法预测了 zma-miR164a-5p 的 50 个潜在靶基因(最小折叠自由能低,种子序列匹配度较高)。采用Mir-Trap法分离出zma-miR164a-5p的潜在靶基因mRNA经实时荧光定量PCR检测,THBS4,BCL-9,PLAGL2等基因的mRNA与免疫沉淀之前相比显著升高,暗示这些基因是zma-miR164a-5p 的靶基因。6将人工合成的zma-miR164a-5p与构建有野生型或突变型目的基因序列的双荧光素酶报告质粒共转染到PK15细胞,培养48 h,通过检测荧光值发现野生型的荧光活性显著降低,突变型的荧光活性无显著变化,表明zma-miR164a-5p可以特异地作用于3个猪的基因(CSPG4,OTX1,PLAGL2)的靶位点使荧光素酶活性降低。本试验的结果表明猪采食玉米后,玉米miRNA可以在猪的血清和组织中检测到,玉米来源的植物miRNA具有靶向调节某些猪内源性mRNA的潜力。