B7-1是表达于抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)表面的重要协同刺激分子，其相应的受体是表达在T细胞表面的CD28家族分子。B7-1与CD28结合是介导T细胞活化、增殖、分化及发挥免疫效应所必需的协同刺激信号。若缺乏该信号，T细胞将进入无反应状态（Anergy）或免疫耐受（Tolerance）甚至引起程序性死亡（Apoptosis）。自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID）是自身反应T、B细胞过度活化，产生大量自身抗体，进而导致多系统、多器官受损的一类严重疾病。系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是其典型代表。目前研究发现，B7-CD28协同刺激信号参与了SLE的发生发展，阻断或削弱该信号，可减轻此类疾患的病理损伤。通过建立动物疾病模型模拟人类疾病的发生过程及临床表现是研究疾病发生、发展、转归及寻找新的诊治途径的重要手段。本课题在建立慢性移植物抗宿主病（cGVHD）小鼠狼疮样肾炎模型并对其进行生物学鉴定的基础上，运用自行研制的B7-1单克隆抗体对疾病模型进行干预。通过免疫学、血清学及肾脏病理损伤评价等指标考察抗体对疾病模型的逆转效应及分子机制。以期寻找新的对SLE及相关疾患具有防治作用的特异、高效、低毒的生物制剂。一、B7-1单克隆抗体的制备及鉴定目的：制备鼠抗人B7-1单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法：采用体内诱生腹水法制备单抗；Protein G免疫亲和层析法纯化抗体；流式细胞术分析单抗对人及小鼠细胞膜型B7-1分子抗原表位的识别。结果：经体内诱生腹水法制备单抗，小鼠腹水形成阳性率约为80%，腹水收获量平均为3.5ml/只小鼠；经免疫亲和层析法纯化，腹水中抗体蛋白的得率为3.2mg/ml；B7-1单克隆抗体与转人B7-1基因小鼠成纤维细胞株L929-B7-1以及小鼠脾脏细胞的阳性结合率分别为99.3%及65.4%。结论： B7-1单克隆抗体能够特异性识别相应的抗原分子。二、慢性移植物抗宿主病小鼠狼疮样肾炎模型的建立及生物学鉴定目的：构建慢性移植物抗宿主病（cGVHD）小鼠狼疮样肾炎模型并对其进行生物学鉴定。方法：将8周龄雌性(C57BL/6×BALB/c) F1小鼠随机分为2组，造模组于0、3、7和11d经尾静脉注射亲代雌性BALB/c小鼠脾脏细胞107/100μL/只。正常对照组给予等量生理盐水。末次注射后第7天，免疫荧光及流式细胞术分析小鼠脾脏中巨噬细胞（CD11b+）、树突状细胞（CD11c+）、中性粒细胞（Gr1+）及抗体产生细胞（CD21+等）的阳性百分率；每2周定期检测血清中抗双链DNA抗体(ds-DNA)、抗核抗体(ANA)含量；每月定期检测尿蛋白含量。3个月后处死小鼠，经HE染色观测肾脏病理变化，石蜡切片直接免疫荧光法分析免疫复合物（IC）的沉积以及透射电镜观察肾小球超微结构的改变。结果：造模组小鼠脾脏中CD11b+、CD11c+及Gr1+细胞的百分率较对照组明显升高（p<0.05），同时B细胞协同刺激分子CD21+、CD23+、CD80+及CD86+的表达上调明显（p<0.05）；建模2周，70%的小鼠血清中可检测到抗dsDNA抗体和ANA，4周时达90%；建模3个月，70%的小鼠出现蛋白尿，蛋白含量为++~++++；HE染色及镜下观察，出现肾小球肿胀及淋巴细胞浸润；直接免疫荧光法呈现大量IC沉积；透射电镜下可见造模组小鼠肾基底膜节段性增厚等病理改变。结论：成功建立慢性移植物抗宿主病小鼠狼疮样肾炎模型。三、B7-1单克隆抗体对小鼠狼疮样肾炎的免疫干预效应及分子机制研究目的：探讨B7-1单克隆抗体通过阻断B7-1/CD28信号通路对狼疮样肾炎模型的免疫干预效应及其分子机制。方法：按上述建模方法，取F1代小鼠随机分为3组，即造模组、抗体干预组及对照组。每组15只。干预组在末次注射淋巴细胞后第1、3、5、8及15d分别尾静脉注射B7-1抗体(克隆4E5)200μg/只，然后每月再注射1次，连续注射2次。造模组同一时间给予等剂量的Ig同型对照。按照上述时间点分析脾脏中巨噬细胞（CD11b+）、树突状细胞（CD11c+）、中性粒细胞（Gr1+）及抗体产生细胞（CD21+等）的阳性百分率，抗双链DNA抗体(ds-DNA)、抗核抗体(ANA)含量，尿蛋白含量，免疫复合物（IC），肾小球超微结构等指标。结果：免疫荧光及流式细胞术分析结果显示，抗体干预组小鼠脾脏细胞CD11b+、CD11c+及GR1+等分子的表达及脾脏B细胞CD21+、CD23+、CD80+及CD86+等分子的表达均低于造模组（p<0.05）；4周后，造模组90%的小鼠血清能检测到抗dsDNA抗体和ANA的表达，而抗体干预组仅40%出现阳性，且抗体滴度明显低于造模组（p<0.05）；3个月时70%的造模组小鼠出现蛋白尿，蛋白含量为++~++++，抗体干预组仅有20%，且蛋白含量为+~++； HE染色后镜下观察，造模组肾脏组织出现肾小球肿胀，淋巴细胞浸润等典型的炎性改变，但抗体干预组仅部分出现肾小球体积轻度增大，少许淋巴细胞浸润，毛细血管腔及球囊腔体积基本未变窄；免疫荧光法及透射电镜检查均发现造模组IC沉积，抗体干预组的肾小球轮廓较清晰，IC的沉积明显少于造模组；通过透射电镜对超微结构的观察，发现造模组出现基底膜节段性增厚等病理改变，抗体干预组基底膜厚度均匀，无明显病理改变。结论：B7-1单克隆抗体通过与相应抗原分子结合可抑制免疫细胞的活化，逆转狼疮样肾炎的病理损伤，提示该类特异性抗体对SLE或cGVHD等疾患具有潜在的防治作用。