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脂肪酸转位酶(fatty acid translocase，FAT/CD36)是介导脂肪酸跨膜转运的重要载体蛋白，其分子量为88 kDa，属细胞膜上的糖蛋白。本试验采用cDNA末端快速扩增法(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)克隆了鸡FAT/CD36 cDNA的全序列，并对其核苷酸和氨基酸序列在不同物种间进行了同源性比较和结构分析。在此基础上，选用22、29、42和56日龄的黄羽肉鸡公鸡和母鸡各6羽，分别采集胸肌、腿肌、皮下脂肪和腹脂样品，采用实时荧光定量PCR方法检测了FAT/CD36 mRNA以及与脂肪代谢相关的脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)、脂肪酸合成酶(fatty acidsynthase，FAS)和脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acid binding protein，A-FABP)mRNA的表达水平，并分析了上述基因表达水平之间的相关性。本试验还扩增了FAT/CD36胞外区部分抗原表位序列，构建了原核表达载体，并诱导表达和纯化了融合蛋白，旨在为进一步利用主动免疫法研究FAT/CD36的生物学功能和鸡脂肪沉积的生物调控提供基础。
研究结果如下：
1．鸡FAT/CD36的cDNA克隆
(1)采用RACE方法克隆了鸡FAT/CD36 cDNA的全序列，GenBank收录号为DQ323177。鸡FAT/CD36 cDNA的序列全长2243 bp，其中包括5'端非翻译区(untranslated region，UTR)332 bp，3'URT 495 bp和开放阅读框(open reading frame，ORF)1416 bp。
(2)核苷酸序列分析结果表明，鸡FAT/CD36 cDNA与人(NM001001548)和鼠(NM007643)FAT/CD36的cDNA同源性分别为66％和66.5％。5'和3'-RACE方法扩增得到鸡FAT/CD36 cDNA序列与已公布的预测序列相比，ORF多129 bp，3'URT也较预测序列多495 bp。
(3)预测编码蛋白分析结果表明，鸡FAT/CD36编码471个氨基酸残基，与人和鼠FAT/CD36相比缺失第110位氨基酸残基，其氨基酸序列与人和鼠的同源性分别为61.2％和62.7％。 FAT/CD36包括17个抗原决定簇和两个跨膜区，信号肽序列切割位点在第20和21位氨基酸之间。
2．鸡肌肉和脂肪组织中FAT/CD36以及其它脂肪代谢相关基因mRNA的表达
(1)公鸡腿肌和腹脂FAT/CD36 mRNA的表达水平随日龄的增加逐渐升高，其中腹脂的表达水平在所检测的各组织中最高：母鸡腹脂FAT/CD36 mRNA的表达水平在生长早期(22和29 d)较高，但在后期(42和56 d)反而有下降趋势。
(2)公鸡胸肌和腿肌LPL mRNA的表达水平在42 d时最高，56 d时表达水平出现下降趋势，而腿肌的整体表达量高于胸肌。母鸡腿肌和腹脂LPL mRNA的表达水平随日龄的增加出现下降趋势，同一日龄时腿肌的表达量高于胸肌，腹脂的表达量高于皮下脂肪。
(3)公鸡胸肌FAS mRNA的表达水平在56 d时最高，皮下脂肪和腹脂FASmRNA的表达水平随日龄的增加出现下降趋势。母鸡胸肌、腿肌和腹脂FAS mkNA的表达水平随日龄的增加也出现下降趋势。
(4)公鸡皮下脂肪和腹脂A-FABP mRNA的表达水平在22 d时显著高于其他日龄；母鸡腹脂A-FABP mRNA的表达水平在22 d时也显著高于其他日龄。
(5)相关性分析结果表明，公鸡和母鸡胸肌FAT/CD36 tuRNA的表达与LPLrnKNA的表达具有显著的相关性；皮下脂肪和腹脂FAS mRNA的表达与A-FABPmRNA的表达均有显著的相关性。母鸡腿肌和皮下脂肪FAT/CD36 mRNA的表达与LPL、FAS mRNA的表达也呈现显著的相关性。
3．原核表达载体pET-FAT/CD36的构建及其表达
(1)将扩增的FAT/CD36胞外区部分抗原表位基因片段与pET-32(+)质粒进行重组，成功构建了原核表达载体pET-FAT/CD36，并在大肠杆菌BL 21菌株中进行表达。经0.5 mmol/L IPTG、37℃诱导6h后，能够高丰度表达约29 kDa的目的蛋白条带，表达量占菌体总蛋白的32％，表达产物主要以包涵体的形式存在。
(2)采用亲和层析和透析法对目的蛋白进行纯化后，经SDS-PAGE分析，蛋白的条带单一清晰(约29 kDa)，纯度约为76.8％。