结核病是一种古老的细菌性疫病,是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染或者长期潜伏引起的严重危害人类和动物健康的传染病。在世界范围内,大约有二十亿人潜伏感染了结核分枝杆菌,造成了每年约两百万人的死亡,它仍然是引起发病率和死亡率的主要病原。2012年Eui-H ong Byun等人将结核分枝杆菌的分泌蛋白通过液相色谱法分离并收集,并用不同管数的蛋白处理DC细胞,发现Rv0315蛋白可以通过激活NF-κB信号通路以及MAPK信号通路显著性的诱导DC细胞的成熟,是一个新发现的潜在的免疫性抗原。为了解决结核分枝杆菌的耐药性以及市场上现有疫苗效果的局限性这一现状,我们需要探究新的结核疫苗候选分子的一些特性,因此开展了关于Rv0315的结构和功能的研究。利用结构生物学平台我们首次解析了Rv0315的三维结构,并对它的功能以及发挥功能的机制进行了研究和探讨。具体研究内容如下:Rv0315属于β-1,3葡聚糖酶家族。β-1,3葡聚糖酶属于糖苷水解酶16家族,他们具有序列和结构的同源性。基于这个共性,我们首先从NCBI数据库中将目前已知结构和功能的所有β-1,3葡聚糖酶的氨基酸序列导出,并将它们与Rv0315一起做了氨基酸的多序列比对,Rv0315在序列上展示出与β-1,3葡聚糖酶较高的序列同源性,保守的两个谷氨酸催化位点以及钙离子结合位点都是存在的。通过序列比对我们发现Rv0315属于β-1,3葡聚糖酶家族。GH16家族的β-1,3葡聚糖酶还有一个特点就是结构的同源性也很高,基于β-1,3葡聚糖酶家族的这个共性,我们首先构建了H37Rv株Rv0315全长的表达质粒pET42b-Rv0315,利用大肠杆菌表达系统获得了可溶性表达的蛋白。通过实验室已有的晶体筛选试剂盒筛选和优化得到一个分辨率达1.7?的晶体,收集数据并通过分子置换的方法解析了Rv0315的结构。由Rv0315的结构可以看出它符合β-1,3葡聚糖酶的结构特征,包括16个β折叠形成的两个β片层,β片层弯曲形成一个凹面,是一个催化活性中心;两个较短的α螺旋和一个钙离子。通过以上从序列和结构上分析,我们发现rv0315是一个β-1,3葡聚糖酶。rv0315是一个没有活性的β-1,3葡聚糖酶。细菌产生的β-1,3葡聚糖酶都属于糖苷水解酶16家族,所有的β-1,3葡聚糖酶都可以水解β-1,3糖苷键的糖,例如昆布多糖,少部分也可以水解β-1,3-1,4糖苷键的糖,例如大麦来源的β葡聚糖。rv0315是一个β-1,3葡聚糖酶,所以我们通过dns实验测定了其对昆布多糖以及大麦来源的β葡聚糖的水解活性。奇怪的是,rv0315既不能降解昆布多糖,同时对大麦来源的β葡聚糖也没有可检测到的水解活性。从以上结果可知,rv0315是一个没有活性的β-1,3葡聚糖酶。我们将目前已知结构和功能的gh16家族的β-1,3葡聚糖酶做了进化树分析,结果显示rv0315与海鱼分枝杆菌的β-1,3葡聚糖酶(pdb号4pq9)形成了一个独立的进化分支。4pq9的结构已经解析,功能没有相关的报道,相关文章对该基因的标注是β-1,3葡聚糖酶。我们合成了4pq9基因并成功获得了可溶性的蛋白,我们利用同样的方法检测了4pq9的水解活性,结果表明4pq9也是一个没有活性的β-1,3葡聚糖酶。我们发现了gh16家族β-1,3葡聚糖酶中一个独立的进化分支,这个分支是由两个没有活性的β-1,3葡聚糖酶组成。rv0315没有多糖水解活性的分子机制。我们通过比对rv0315与海洋细菌的β-1,3葡聚糖酶(pdb号4bow)的结构来解释rv0315没有水解活性的机制。4bow对昆布多糖有很高的催化活性,同时也可以水解mlg。mlg是一种β-1,3-1,4葡聚糖,跟大麦来源的β葡聚糖相似。通过结构比较我们发现,4bow中-2位以及-3位跟多糖结合相关的氨基酸残基在gh16家族β-1,3葡聚糖酶中都是保守的,但rv0315中都是缺失或者突变的,而-1位的跟葡萄糖单位结合的氨基酸在rv0315中也是保守的。所以,目前所知道的rv0315唯一可以结合的分子就是乙二醇。乙二醇分子是在rv0315结构中发现的,结合的位置跟-1位的葡萄糖单位所在的位置类似。从整体结构比较可以看出,rv0315的催化裂开口很大。由结构比较的结果可以看出rv0315由于结合底物相关的氨基酸的缺失或者突变使其催化裂的开口较大,导致rv0315不能结合多糖进而不能水解多糖。我们通过itc实验验证了rv0315确实不能结合昆布多糖,而4bow-e269s可以结合多糖并呈现很好的拟合曲线。一个昆布多糖分子可以结合两个4bow-e269s分子。Rv0315的结构与其发挥免疫学功能的关系。Rv0315虽然是一个没有活性的β-1,3葡聚糖酶,但其两个担当催化作用的谷氨酸位点还是存在的。Rv0315可能在长期进化过程中失去水解多糖的功能进而参与发挥免疫学功能。因为Rv0315开口比较大,当结核分枝杆菌入侵机体时可能更容易暴露而受到免疫相关分子的攻击,因此参与适应性免疫应答。为了验证我们的推测,我们通过荧光素酶报告实验来检测Rv0315以及突变体Rv0315E176S、Rv0315D289A对NF-κB信号通路的激活情况,Rv0315以及Rv0315D289A可以激活NF-κB信号通路并且呈剂量依赖性。而催化活性位点176位的突变体则不能激活NF-κB信号通路。此外,我们还用不同浓度的Rv0315以及突变体蛋白处理DC细胞,检测它们诱导DC细胞成熟的能力,结果跟荧光素酶报告实验的结果相同,Rv0315和Rv0315D289A可以诱导DC细胞成熟,而Rv0315E176S则不能诱导DC细胞的成熟。综上所述,Rv0315可能是从GH16家族的β-1,3葡聚糖酶进化而来,这个没有活性的成员为GH16家族β-1,3葡聚糖酶提供了新的认识。我们研究发现结核分枝杆菌中没有活性的β-1,3葡聚糖酶可以驱化Th1细胞免疫应答,176位谷氨酸是其发挥免疫学功能的关键氨基酸,这为结核疫苗的开发提供了新的依据。