猪圆环病毒2型是一种严重危害养猪业的传染病，抑制机体免疫系统，增加其他病原入侵的几率，造成机体继发感染，使病情更加复杂，危害更加严重。该病流行于世界各养猪国家，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。目前已经发现了不同全基因长度的PCV2毒株，并在不同时间不同地区呈现不同的主导亚型，说明PCV2处于不断变异中，特别是在疫苗免疫压力下，PCV2的变异情况更值得监测与分析。目前检测PCV2抗体的方法有很多，在临床上主要是ELISA方法，研究最多的是以ORF2编码的蛋白为包被抗原建立ELISA方法，但无法区分是疫苗抗体还是野毒感染抗体。本研究扩增了PCV2的全基因序列并对在免疫压力下的圆环病毒的变异情况进行了分析；构建了原核表达质粒pET32α-ORF3和人工合成了pET32α-ORF2，并以纯化的重组蛋白为包被抗原建立了检测PCV2抗体的ELISA方法，为PCV2的分子流行情况及防治诊断提供新的检测方法。为了解PCV2在免疫压力下的流行、变异及进化情况，本研究对2013年广东省PCV2疫苗免疫猪场中发生PCV2感染的病猪血清进行PCV2病毒分离，参考GenBank上已发表的PCV2全基因序列，设计3对引物，用PCR方法扩增其全基因序列，测序并进行序列分析。结果分离到了9株PCV2毒株，全基因序列长度都为1767bp。同源性分析表明，9株PCV2分离株核苷酸同源性为93.6%-99.4%，与2012年广东省分离株同源性为94.5%-99.7%，与2011年广东省分离株同源性为94.2%-99.7%，与GenBank中其他PCV2分离株的同源性为92.5%-99.7%。9株PCV2的ORF1、ORF2、ORF3核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性分别为94.9%-99.9%和95.3%-100%、89.0%-99.9%和86.4%-100%、92.4%-100%和86.8%-100%，存在一定的变异。氨基酸序列多态性分析表明ORF1氨基酸有27位，ORF2氨基酸有35位，ORF3有24位发生了变异，与2011年和2012年分离株氨基酸相比较，ORF1和ORF3发生了较大变异，ORF2基本没有变异。基因型分析表明，有5株属于PCV2d，3株属于PCV2b，1株属于PCV2a。对2011年至2013分离的PCV2基因组特征进行分析发现PCV2核苷酸序列比较稳定，与世界其他分离株具有较高的同源性，PCV2b和PCV2d亚型已经成为当前的流行毒株，在免疫压力下，PCV2d有可能会替代PCV2a和PCV2b成为主导毒株。根据分离毒株YD01(YB2013)基因序列，设计1对特异性引物用PCR方法扩增ORF3基因，并克隆到原核表达载体pET32α(+)上，构建原核表达质粒pET32α-ORF3，同时根据密码子的偏好性优化去掉信号肽的ORF2基因，人工合成了原核表达质粒pET32α-ORF2。经IPTG诱导表达后纯化，以纯化后的重组蛋白作为包被抗原，初步建立了两种检测PCV2抗体的间接ELISA方法。确定最佳的ELISA的工作条件：ORF2重组蛋白最佳包被浓度为1.69μg/mL，血清最佳稀释倍数为1:50，二抗最佳工作浓度为1:15000；ORF3重组蛋白最佳包被浓度为0.51μg/mL，血清最佳稀释倍数为1:200，二抗最佳工作浓度为1:10000。批内批间重复性试验变异系数都小于7%，与其他猪疾病阳性血清没有交叉反应。ORF2蛋白ELISA结果与商品试剂盒符合率为97.4%，ORF3蛋白ELISA阳性率为52.6%。ORF2蛋白ELISA可以用于临床疫苗抗体的检测，ORF3蛋白ELISA可以用于疫苗免疫血清中的野毒抗体检测。