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糖尿病肾病(diabetic kidney disease.DKD)是糖尿病(diabetes mellitus.DM)严重和常见的微血管并发症之一,其发病率逐年上升,严重影响了患者的生活质量。DKD的基本病理改变包括肾小球肥大、细胞外基质沉积、肾小球硬化和肾间质纤维化,但其病因非常复杂,发病机理至今尚未完全明确。近几年,上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transtion,EMT)被认为是导致肾脏纤维化发生的重要机制之一,转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1, TGF-β1)是致纤维化的关键因子,可以通过多条信号转导通路参与转分化。研究表明,DKD时高血糖、氧化应激、糖基化终末产物、血管紧张素Ⅱ等因素导致TGF-β/Smad信号转导通路激活,介导了细胞外基质产生与降解失衡、系膜细胞增生、肾小管上皮细胞转分化、足细胞损伤等病理改变,加速了肾脏纤维化进程。整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)是TGF-β/Smad信号转导通路中一个重要的下游因子,在TGF-β介导的EMT中发挥重要作用。TGF-β1通过Smad2／3增加ILK的表达,后者可增加纤维连接蛋白、基质金属蛋白酶-2及-9的表达,促进细胞外基质沉积,破坏基底膜的完整性,进而导致EMT的发生。最近研究表明,作为肾小球滤过屏障重要组成部分的足细胞在高糖、氧化应激等因素刺激下可以发生表型改变、转分化,进而破坏肾小球滤过屏障的完整性,导致蛋白尿的发生,加速肾脏纤维化进程。足细胞EMT为足细胞与蛋白尿的关系提供了一种新的解释,成为蛋白尿形成和肾脏纤维化机制研究中重要的切入点。导师赵宗江教授将传统医学与现代医学相结合,提出了DKD“肾痿”假说,并以“肾痿”假说为指导,结合临床经验组方了糖肾平胶囊(以下简称糖肾平),用于治疗DKD取得了较好的临床疗效。导师课题组前期研究发现,糖肾平可降低DKD大鼠肾组织MCP.1.CTGF蛋白及mRNA的表达,并可通过抑制TGF-β1/Smad7.NF-KB及TGF-β1/p38MAPK信号转导通路减少足细胞损伤、凋亡,减轻肾脏病理损害,保护DKD大鼠肾功能。本研究以足细胞EMT为切入点,采用免疫组化、原位杂交、Western blot及RT-PCR方法,探讨糖肾平干预DKD TGF-β1-Smad2/3-ILK信号转导通路的作用机制为DKD“肾痿”假说的研究提供实验依据。目的：动物实验：采用一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导DKD大鼠,以厄贝沙坦为实验对照药物,观察糖肾平对DKD大鼠的药效学和氧化应激水平的影响,并采用免疫组化、原位杂交和RT-PCR方法观察糖肾平对DKD大鼠肾组织中TGF-β1, Smad2/3, ILK. CD2AP, α-SMA蛋白及mRNA表达的影响。细胞实验：采用Vestern blot及RT-PCR方法观察高糖+LPS对足细胞表型的影响,以及糖肾平对足细胞TGF-β1, Smad2/3. ILK, CD2AP, α-SMA蛋白及mRNA表达的影响。方法：1糖肾平对STZ诱导DKD大鼠药效学的影响：清洁级Wistar大鼠74只按体质量随机分为正常组10只,造模组64只,造模组采用一次性腹腔注射STZ (45mg/kg)建立糖尿病大鼠模型。造模成功后按体质量随机分为模型组、厄贝沙坦组、糖肾平小剂量组、糖肾平大剂量组,并进行灌胃治疗。观察大鼠一般状态、体质量,检测24h尿蛋白定量。14周时,股动脉取血检测血清中尿素氮(blood urea nitrogen, BUN),肌酐(serum creatinine, Scr)、甘油三酯(triglyeride, TG)含量；摘取大鼠肾脏,称取大鼠肾质量；肾组织石蜡切片进行普通HE染色、Mallory, Masson, PASM-HE染色观察肾组织病理形态变化,透射电镜观察肾小球血管基底膜及足突等超微结构的变化。2ELISA法：检测血清中一氧化氮(nitric oxide, NO)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)水平。3免疫组化：检测大鼠肾组织中TGF-β1Smad2/3, ILK, CD2AP, a-SMA蛋白表达4原位杂交：检测大鼠肾组织中TGF-β1, Smad2/3, CD2APmRNA表达。5RT-PCR:检测大鼠肾组织中TGF-β1, Smad2/3, ILK, CD2AP, α-SMAmRNA表达。6体外细胞培养实验：体外培养大鼠肾小球足细胞,以高糖(25mmol/L),脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(1μg/mL)刺激足细胞建立细胞模型,并用糖肾平含药血清干预足细胞36h,观察足细胞表型变化,采用Western blot及RT-PCR方法检测足细胞TGF-β1. Smad2/3, ILK, CD2AP,α-SMA蛋白及mRNA的表达情况。7实验数据用SPSS17.0进行统计学处理。结果：1糖肾平对STZ诱导DKD大鼠药效学的影响经过糖肾平治疗后,大鼠一般状态良好；与模型组比较,糖肾平大、小剂量组大鼠体质量均有不同程度增长(P<0.01),肾质量体质量比值显著降低(P<0.01),24h尿蛋白定量显著减少(P<0.01),血清BUN、TG含量显著降低(P<0.01),Scr含量降低(P<0.05),肾小球硬化指数和肾间质损伤指数显著降低(P<0.01),糖肾平小剂量组肾小球基底膜轻度增厚、足突轻度融合糖肾平大剂量组肾小球基底膜、足突基本正常,肾脏病理改变明显减轻。2糖肾平对STZ诱导DKD大鼠氧化应激的影响与模型组比较,糖肾平大、小剂量组NO、SOD含量显著升高(P<0.01),MDA含量显著降低(P<0.01)。3糖肾平对DKD大鼠肾组织TGF-β1、Smad2/3、ILK、CD2AP、α-SMA蛋白表达的影响免疫组化显示：正常组大鼠肾脏固有细胞有少量TGF-β1、Smad2/3、ILK、 α-SMA蛋白表达,明显低于模型组(P<0.01)；与模型组比较,治疗组大鼠肾脏固有细胞TGF-β1、ILK蛋白表达降低,有统计学差异(P<0.05),Smad2/3、α-SMA蛋白表达明显降低,有显著统计学差异(P<0.01),且糖肾平大剂量组疗效最佳。正常组大鼠肾小球足细胞有大量CD2AP蛋白表达,明显高于模型组(P<0.01)；与模型组比较,厄贝沙坦组、糖肾平大剂量组肾小球足细胞CD2AP蛋白表达升高,有统计学差异(P<0.05)。糖肾平小剂量组肾小球足细胞CD2AP蛋白表达高于模型组。4糖肾平对DKD大鼠肾组织TGF-β1、Smad2/3、ILK、CD2AP、α-SMAmRNA表达的影响4.1原位杂交：正常组大鼠肾脏固有细胞有少量TGF-β1、Smad2/3mRNA表达,明显低于模型组(P<0.01)；与模型组比较,糖肾平大剂量组肾脏固有细胞TGF-β1、Smad2/3mRNA表达明显降低,有显著统计学差异(P<0.01),糖肾平小剂量组肾脏固有细胞TGF-β1、Smad2/3mRNA表达有所降低。正常组大鼠肾小球足细胞有大量CD2APmRNA表达,明显高于模型组(P<0.01)；与模型组比较,治疗组肾小球足细胞CD2APmRNA表达明显升高,有显著统计学差异(P<0.01),且糖肾平大剂量组疗效最佳。4.2RT-PCR:模型组大鼠肾组织TGF-β1、Smad2/3、ILK、 α-SMAmRNA表达明显高于正常组,有显著统计学差异(P<0.01)；与模型组比较,糖肾平大剂量组大鼠肾组织TGF-β1、Smad2/3、ILK、α-SMAmRNA表达明显降低,有显著统计学差异(P<0.01),糖肾平小剂量组大鼠肾组织Smad2/3、ILK、 α-SMAmRNA表达明显降低,有显著统计学差异(P<0.01),且糖肾平大剂量组疗效优于糖肾平小剂量组。正常组大鼠肾组织CD2APmRNA表达明显高于模型组,有显著统计学差异(P<0.01)；与模型组比较,治疗组CD2APmRNA表达明显升高(P<0.01)。5足细胞表型变化正常足细胞呈分叉状,形态不规则,突起较长、较细、较多,有些突起末梢还会分出树枝状的分叉。高糖和高糖+LPS作用后,贴壁细胞大量失去突起,胞体变大。糖肾平干预组足细胞形态均有所改善,突起增多,胞体变小,糖肾平大剂量组最为明显。6糖肾平对足细胞TGF-β1.Smad2/3.ILK.CD2AP.α-SMA蛋白及mRNA表达的影响6.1Western blot:正常组足细胞高表达CD2AP蛋白,少量表达TGF-β1. P-Smad2/3.ILK.α-SMA蛋白。与正常组比较,高糖组和高糖+LPS组足细胞CD2AP蛋白表达明显降低,TGF-β1.P-Smad2/3.ILK.α-SMA蛋白表达明显升高,有显著统计学差异(P<0.01)。与高糖+LPS组比较,糖肾平大、中、小各剂量组足细胞TGF-β1.P-Smad2/3.α-SMA蛋白表达明显降低(P<0.01),CD2AP蛋白表达明显升高(P<0.01)。6.2RT-PCR:与正常组比较,高糖组和高糖+LPS组足细胞CD2APmRNA表达明显降低,TGF-β1.Smad2/3.ILK.α-SMAmRNA表达明显升高,有显著统计学差异(P<0.01)。与高糖+LPS组比较,糖肾平大、中、小各剂量组足细胞TGF-β1. Smad2/3. ILK. α-SMAmRNA表达明显降低(P<0.01),CD2APmRNA表达明显升高(P<0.01)。结论：1糖肾平可以改善DKD大鼠的一般状态,增加DKD大鼠体质量,降低肾质量体质量比值、24h尿蛋白定量,明显减轻DKD大鼠肾脏病理损害,对DKD大鼠肾脏有一定的保护作用。糖肾平大剂量组疗效明显优于小剂量组。2糖肾平能够降低DKD大鼠血清MDA含量,升高NO.SOD含量,改善DKD大鼠氧化应激状态,起到保护肾功能的作用。3糖肾平能够下调肾组织和足细胞TGF-β1.Smad2/3.ILK.α-SMA蛋白及]mRNA的表达,上调CD2AP蛋白及mRNA的表达,从而逆转足细胞转分化。综上所述,糖肾平通过TGF-β1-Smad2/3-ILK信号转导通路,干预足细胞转分化,维持足细胞形态功能的稳定性,从而保障肾小球滤过屏障的功能,减轻“肾痿”时的肾小球硬化和肾间质纤维化,保护DKD肾功能,延缓其病程进展。