随着纳米技术的迅速发展，纳米材料逐渐被应用到生命科学领域，为其研究和发展提供了新的技术和手段。磁性纳米粒子(magnetic nanoparticles，MNPs)作为纳米材料的一个重要组成部分，由于其在缓冲体系中具有高比表面积和易分离的特点，目前己被广泛应用于各种生物信号的检测等方面。另外，化学发光具有安全、灵敏度高，线性范围宽等特点，为病原体检测提供了一个良好的平台。本论文以E.coli O157:H7为检测对象，结合化学发光和磁分离技术的优点，建立了快速、灵敏和实用的检测新技术。具体内容包括：　　 1.以亚麻酸为改性剂的磁性纳米颗粒的制备　　 通常为了使颗粒不发生团聚，能很好地分散于液相中，需对颗粒进行表面改性使颗粒表面吸附一层聚合物，从而产生空间斥力克服粒子间的引力，提高微粒在溶液中的分散性。一般所用的改性剂为油酸。在实验中我们发现，通过油酸(oleic acid，OA)和γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷（γ-Methacryloxypropyltrim ethoxysilane，MPS）作为Fe3O4表面改性剂时，与甲基丙烯酸甲酯(methylmethacrylate，MMA)聚合耗时长，聚合过程中Fe3O4破乳团聚严重，有结块产生，包埋有单体的磁性颗粒产率低，而且修饰过程中有毒性。α-亚麻酸(α-Linolenic Acid，LNA)比OA多两个双键，更容易聚合，只需要5h聚合时间，且无毒无害。我们首次用LNA同时作为Fe3O4表面改性剂和与MMA的交联剂，成功合成了PMMA/(LNA/Fe3O4)MNPs，并在其表面上修饰SiO2，得到了SiO2/(PMMA/LNA/Fe3O4)MNPs。由结果可知，制备出的MNPs具有明显的核壳结构，平均直径为500nm，且为圆颗粒，大小比较均一，具有超顺磁性，饱和磁化强度为1.7374emu/g。　　 2.化学发光检测方法的优化　　 虽然国外已有一些化学发光试剂盒也采用3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-羟基)苯-1,2-二氧杂环丁烷磷酸(3-(2’-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3”-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane，AMPPD）与碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）这一高效化学发光体系，但其价格高昂。我们利用国产的AMPPD固体粉剂，建立并优化了化学发光的条件，实现了该化学发光试剂的国产化。其化学发光强度在30min达到最大值，并保持稳定；比较了AMPPD与ALP在不同缓冲液体系中的发光值，以在C缓冲液中反应的化学发光强度最高；其发光强度随酶浓度的增加而增加，在ALP与AMPPD的浓度比小于10mg ALP/mol AMPPD时，可以获得恒定的化学发光强度;确定了光电倍增管（photomultiplier,PMT）录敏度参数设置为160、曝光时间设置为1s的化学发光检测结果的信噪比（Signal to Noise Ratio,S/N）最大，为今后利用化学发光的高通量多样本测定打下了基础　　 3.一种实用的化学发光磁酶免疫E.coli O157:H7检测方法的建立及应用　　 虽然基于化学发光和MNPs的免疫鉴定方法已经被应用于检测Ecoli O157:H7，但是由于针对相应病原体的抗体筛选和修饰等的步骤耗时费力，不适于对多种病原体的进行筛查。我们制备了免抗大肠杆菌E.coil O157:H多克隆抗体包被的免疫磁性纳米颗粒（immunomagnetic nanoparticles，IMNPs），富集病原菌后与鼠抗E.coli O157:H7的单克隆抗体形成双抗夹心，采用ALP标记的马抗鼠IgG(ALP-Ab)与单抗结合，加入AMPPD检测化学发光。实验比较了甘氨酸和NaBH4对IMNPs剩余活性醛基的封闭效果，以及检测E.coli O157:H7的特异性和敏感性。结果表明，NaBH4对活性醛基的封闭效果优于甘氨酸，以D群宋内氏志贺氏菌、B群福氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和霍乱弧菌及E.coli Top10f'为对照的比较实验显示，该检测方法具有良好的特异性，以1mL菌液为检测体积时对E.coli O157:H7的检测灵敏度为103cell/mL，整个方法的检测时间约为3h。该方法用多克隆抗体和单克隆抗体分别作为捕获抗体及检测抗体，避免采用成对单抗的筛选过程；利用ALP标记的二抗省去了繁琐的酶标记单抗的过程，只要有病原体的多克隆抗体和一个单抗就可以利用本实验方法进行检测，所用试剂较易从市面获得，而且借助微孔板及其检测设备，在实现多样本、多位点检测方面，具有广泛的应用前景。　　 4.基于磁性纳米颗粒富集，生物素信号放大和化学发光的DNA检测新方法的建立及应用　　 虽然前人在核酸传感器的研制过程中，加入了磁性颗粒的磁分离作用，同样也灵活运用了酶促化学发光信号放大技术，但他们检测的标志物基本都是人工合成的单一单链小片段的核酸分子。对于多种、双链、较长DNA的检测方法尚未见相关报道。因此，建立一种基于磁分离和化学发光信号放大并适用于检测多种、较长双链的核酸分子的新检测方法是很有必要的。为此我们以E.coli O157:H7特征基因为检测对象，设计了一种新的基于磁分离和化学发光的E.coli O157:H7核酸检测方法：将编码E.coli O157:H7的O157抗原的基因rfbE的探针修饰固定在自制MNPs上。通过掺入生物素标记单体，利用多重PCR(Polymerase chain reaction)或全基因组扩增等手段对样本DNA进行标记扩增，扩增的DNA片段与修饰在复合MNPs上的探针杂交后，在外磁场下分离除去非特异性吸附片段，与修饰有ALP的链亲合素(ALP-StreptavidiN,ALP-SA)结合，洗涤后加入AMPPD，通过化学发光读板机读取每孔的发光强度，实现了快速分析鉴定。　　 系统比较了SiO2/(PMMA/LNA/Fe3O4)纳米颗粒表面的醛基和羧基分别与氨基化探针的结合，及Fe/Au与巯基探针结合后对前述方法检测特异性的影响，结果表明，在探针修饰过的MNPs上，非特异性结合在MUPs表面的DNA主要不是被MNPs表面吸附，而是缠绕在MNPs的探针之间。而采用羧基化MNPs为探针载体时，由于其表面存在的负电荷可以排斥同样带负电的DNA，从而防止了缠绕，检测背景值低、特异性好。　　 5.基于羧基化MNPs和化学发光检测ds较长DNA的条件优化　　 针对检测PCR或全基因组扩增产物的需要，以PCR扩增出的678 bp编码E.coli O157:H7中O157抗原的rfbE基因片段为检测目标，优化了实验条件：SA修饰MNPs的最佳浓度为1mM;探针固定在MNPs上的最佳时间为12 h；杂交最佳时间为30 min；每mg MNPs上结合400pmol探针时化学发光值最高；该方法的检测限为3.3 pM（30 uL反应体系中含有100 amol的特异产物），线性范围为1 fmol-10 pmol(R2=0.9979)。在与短ssDNA序列检测的比较实验中，我们发现长链dsDNA由于空间位阻的原因比短ssDNA的杂交效率低，且利用模式实验所得到的固相探针杂交的最佳条件并不一定适用于长片段样本。待检测片段的长度、探针杂交部位都是影响杂交效率的主要因素。　　 6.几种可提高本文核酸检测技术灵敏性的方法探索　　 针对不同长度待测片段的实验优化条件并不通用这一结论，我们从化学发光检测仪器的灵敏性、杂交时颗粒的悬浮性、改善空间位阻等方面探索获得了一些通用的提高灵敏度的方法。对比了3种多功能酶标仪的化学发光检测结果。实验证明M5检测结果的信噪比最高。而X3的ALP-SA检测灵敏度比HT高约60倍。　　 计了一种全温微体积混匀孵育及杂交仪，在可制冷加热的温控箱中有直流减速电机驱动的圆盘，离心管可以以垂直于电机轴的方向固定于圆盘的孔中，通过电机带动圆盘转动，可使离心管中的液体颠倒混匀。该仪器提供了更广泛的温度范围，给纳米材料表面的化学、生物大分子修饰及杂交提供适宜的温度，保证了生物大分子的活性和杂交的精度，还特别适用于纳米材料在小体积液相环境中的自动混匀悬浮，保证了纳米材料表面修饰的均匀性。利用该仪器进行本文的核酸检测，可提高灵敏度约3.7倍。　　 为减小空间位阻及减小核酸在探针修饰MNPs表面非特异性缠绕，我们利用葡聚糖作为手臂分子修饰在MNPs的表面，考察了制备过程中超声、离心和只用磁分离手段对葡聚糖修饰效果的影响。电镜结果表明，制备过程中超声和离心影响了修饰效果，磁分离的修饰效果最好。利用可与葡萄糖特异结合的伴刀豆蛋白A（concanavalinA，Con A）的实验也证明，葡聚糖被成功的修饰在了颗粒的表面。将制备的颗粒结合生物素放大和化学发光技术对E.coli O157:H7的O157基因rfbE进行了检测，表现了良好的特异性，其检测灵敏度高于用羧基化MNPs的结果。