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研究背景乳腺癌发病率目前位居世界女性肿瘤第一位，严重危害女性的身心健康。目前每年全球约有120万女性发病，约50万妇女死于乳腺癌。近十年来我国乳腺癌发病率呈快速上升趋势，但是发病年龄却在不断下降，因此乳腺癌的发生发展机制的研究有重要实际意义。科研人员于11年前首次发现大型插入型非编码RNA（Large interveningnon-coding RNA，lincRNA），这是一类长度从几百到上万个核苷酸不等的RNA分子。在哺乳动物基因组中1%的序列转录本为编码RNA，但是基因组中lincRNA的序列转录本却高达4%~9%。因为lincRNA本身并不编码蛋白质，因此最初被看作是RNA聚合酶II转录的副产物，并没有生物学功能。然而近年来的研究表明，lincRNA参与了X染色体沉默、染色质修饰、转录激活及转录干扰等重要调控过程。HOTAIR作为lincRNA的成员之一，与乳腺肿瘤的发生、发展密切相关。HOTAIR是HOXC基因簇的一条反义链，作为组蛋白修饰复合物的脚手架，其5’端结构域与PRC2复合体结合，3’端结构域与LSD1/CoREST/REST复合体结合。而HOTAIR能同时结合这两个复合体，并将其募集到特异性的基因组位点，从而使该染色体处于封闭状态而使其基因沉默。上皮间质转化(epithelia-mesenchymal transition，EMT)是具有极性的上皮细胞转化为具有活动能力的间质细胞，并获得侵袭与迁移能力的过程。EMT存在于人体多个生理和病理过程中，其发生涉及多个信号转导通路与分子机制，并与钙连接素，生长因子，转录因子与微环境等有关。现已证实EMT与肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关。目的探讨HOTAIR与EMT的关系，并通过实验证实二者是否存在相关性，为阐明乳腺癌的发生发展机制提供一定的理论支持；通过构建HOTAIR真核表达载体，并利用过表达及干涉技术检测HOTAIR在乳腺癌细胞系中的表达，研究其对乳腺癌细胞系EMTI发生的影响；收集临床乳腺癌组织标本，通过与癌旁组织标本对照，从组织层面进一步证明了HOTAIR与EMT之间是否存在相关性。方法1)检测HOTAIR在人乳腺癌细胞系中的表达。常规培养人乳腺癌细胞系SKBR3、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-MB-468、MCF-7、T47D、BT549，通过实时定量PCR和RT-PCR，筛选出高表达HOTAIR的乳腺癌细胞系MDA-MB-231；2)构建HOTAIR真核表达载体。我们成功筛选出高表达HOTAIR的乳腺癌细胞系MDA-MB-231后，利用RT-PCR克隆出全长的HOTAIR，并将其克隆入载体pcDNA3.0，挑选单克隆后双酶切鉴定并送测序，证实HOTAIR真核表达载体是否构建成功；3)检测过表达或干涉HOTAIR对乳腺癌细胞系的影响。成功构建HOTAIR真核表达载体后，在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中过表达HOTAIR，通过实时定量PCR检测HOTAIR的表达水平，Western blot检测了EMT相关分子的蛋白表达水平，Transwell实验观察了过表达HOTAIR后细胞侵袭能力是否发生变化，划痕实验观察了细胞迁移能力是否发生变化；将siHOTAIR转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231后，实时定量PCR检测了HOTAIR的表达水平，Western blot检测了EMT相关分子的蛋白表达水平，Transwell实验观察了干涉HOTAIR后细胞侵袭能力是否发生变化，MTT法检测了干涉HOTAIR后细胞增殖情况，流式细胞术检测了干涉HOTAIR后细胞凋亡情况，间接免疫荧光观察了干涉HOTAIR后Snail分子在细胞中的表达情况；4)检测乳腺癌组织标本中HOTAIR的表达。为了从组织层面进一步说明HOTAIR与EMT的关系，我们从西京医院乳腺外科收集了乳腺癌及对应的癌旁组织标本，通过实时定量PCR检测了其中HOTAIR的表达水平，又通过免疫组化实验检测了EMT相关分子的蛋白表达水平。结果1) HOTAIR在不同乳腺癌细胞系中的表达不同，其中在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中表达最高，而在乳腺癌细胞系SKBR3和BT-549中表达最低。本文以乳腺癌细胞系MDA-MB-231为细胞模型进行研究；2)成功构建HOTAIR真核表达载体，命名为pcDNA3.0-HOTAIR。首先在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中过表达HOTAIR，实时定量PCR检测发现转染pcDNA3.0-HOTAIR后，HOTAIR表达上调；Western blot检测发现过表达HOTAIR后EMT相关分子E-cadherin蛋白表达水平下调，而Snail和β-catenin蛋白表达水平则上调；与此同时，Transwell实验观察发现细胞侵袭能力增强，而细胞划痕实验则观察发现细胞迁移能力增强。这证明过表达HOTAIR能促进EMT发生；3)其次我们又在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中干涉HOTAIR，通过实时定量PCR检测发现干涉HOTAIR后，HOTAIR表达显著下调；Western blot检测发现干涉HOTAIR后EMT相关分子E-cadherin蛋白表达水平上调，而Snail和β-catenin蛋白表达水平则下调；干涉HOTAIR后，Transwell实验观察发现细胞侵袭能力增强， MTT实验检测发现细胞增殖减缓，流式细胞术检测发现细胞凋亡增加，间接免疫荧光实验观察发现Snail表达显著降低。这说明干涉HOTAIR后能有效抑制EMT发生。4)通过对临床收集的乳腺癌组织标本进行实时定量PCR，发现HOTAIR在乳腺癌中的表达明显高于对应的癌旁组织；免疫组化实验观察发现，乳腺癌病理分级越高Snail的蛋白表达水平也越高，而E-cadherin的蛋白表达水平则越低。这说明HOTAIR与Snail的表达高度一致，而与E-cadherin的表达相反。结论1) HOTAIR在不同乳腺癌细胞系中表达不同，其中在乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达最高，而在乳腺癌细胞系SKBR3和BT-549中表达最低。2) HOTAIR与EMT关系密切。过表达HOTAIR能促进乳腺癌细胞系EMT的发生；反之，干涉HOTAIR则能有效抑制EMT的发生。3)临床乳腺癌病理分级越高，Snail的表达水平也越高，而E-cadherin的表达水平却越低，EMT现象就越显著；而HOTAIR在乳腺癌中的表达水平显著高于其对应的癌旁组织。这与EMT的趋势高度一致。