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简介:小鼠的假设基因N6-DNA甲基转移酶(mN6A1)(GenBankNo AY456393,2003年)是我所从未分化的人胚胎干细胞中高表达而分化的人胚胎干细胞中低表达的EST(CN304553)入手,通过数据库搜索、拼接、同源比对和分子克隆等手段得到的一个新基因。这个基因对应于一个假设的基因5830445C04Rik,又被称作mN6amt1。生物信息学分析表明这个基因包含DNA甲基转移酶的功能结构域(N6-Mtase)和蛋白质甲基转移酶的功能结构域(HemK-rel-arch),所以我们初步判断它是一个甲基转移酶。在酵母和细菌中它的同源基因分别为Mtq2p和HemK,已被证明是HemK甲基转移酶家族中的成员,分别能够甲基化肽链释放因子1(polypeptide release factors 1,eRF1)和肽链释放因子(polypeptide release factors,RF1和RF2)。在唯一一篇发表的论文(2006年)中,mN6A1被定位于细胞核,但未检测出N-6腺嘌呤的DNA甲基转移酶活性。1.基因mN6A1在小鼠胚胎干细胞分化及胎发育过程中的表达及上游CpG岛的甲基化分析目的:检测基因mN6A1上游CpG岛的甲基化状况以及小鼠胚胎发育过程中mN6A1表达情况。方法:用重亚硫酸盐测序PCR的方法对ESC中mN6A1基因上游CpG岛的甲基化情况进行检测。通过常规RT-PCR检测小鼠胚胎发育过程中2-细胞,4-细胞,8-细胞和囊胚期基因mN6A1的表达情况。通过Real-time PCR检测ESCs自发分化为拟胚体过程中第0,2,4,6,8和10天时mN6A1的表达情况。结果:ESC中mN6A1基因上游CpG岛中5个CpG二核苷酸没有检测到甲基化。小鼠胚胎发育过程中mN6A1表达的RT-PCR分析结果显示:2-细胞和4-细胞时期都没有检测到mN6A1表达,8-细胞和囊胚期有mN6A1表达,且囊胚期表达较高。Real-time PCR检测ESCs自发分化为拟胚体过程中第0,2,4,6,8和10天时mN6A1的表达情况显示,mN6A1表达的变化趋势与mNanong和mSox2相似:第二天表达下降,第四天显著升高,随后几天,除第十天升高外又开始下降。结论:基因mN6A1与ESCs的分化相关。2.被动扩散不是蛋白mN6A1的进核模式目的:小鼠的蛋白mN6A1被法国的学者定位在细胞核,并且认为其进核方式是被动扩散,因为mN6A1蛋白的分子量仅为23 kD。我们实验室在此文献发表之前也已证明蛋白mN6A1定位在细胞核,但我们不认为其进核方式为被动扩散。随后我们对该蛋白的进核方式又做了进一步探讨。方法:准备anti-mN6A1的抗体,以及FITC标记的二抗,直接对细胞p19,GC-1,C2C12进行免疫荧光染色后行荧光显微镜检测。构建真核表达质粒pCMV-Myc-mN6A1转染P19细胞,用anti-Myc抗体以及FITC标记的二抗做免疫荧光染色后行荧光显微镜检测。构建重组融合的绿色荧光蛋白和mN6A1蛋白表达载体pEGFP-c3-mN6A1,转染P19细胞后行荧光显微镜检测。而且分别在转染质粒于P19细胞培养30小时和72小时后做免疫荧光染色进行比较绿色信号入核的细胞比例。在表达质粒pCMV-Myc-mN6A1的基