N-糖基化(N-glycosylation)是指N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)通过β-糖苷键共价连接到Asn侧链NH2上对蛋白质进行的一类修饰。N-糖基化修饰在真核生物蛋白质中非常普遍,在蛋白质的折叠、胞内转运、稳定性、催化活性以及蛋白间的相互作用中起着重要的作用。真核生物蛋白的N-糖链拥有一个由β1,4-连接的双GlcNAc以及外侧三个甘露糖(Man)组成的五糖核心,然后通过连接Man、GlcNAc和半乳糖等形成不同类型的N-糖链。N-糖链内侧与Asn连接的GlcNAc的αl,6-岩藻糖基修饰(核心岩藻糖基化)、末端的a2,6-唾液酸修饰以及分支糖链数目的不同,使得N-糖链拥有复杂多样的结构。真核生物蛋白质的N-糖基化过程没有模板指导,而是在内质网和高尔基体内通过一系列糖基转移酶和糖苷酶以相对随机的方式共同作用,所形成的成熟N-糖蛋白的N-糖链结构一般具有高度的不均一性。虽然N-糖基化的重要性已经长久为人所知,但对N-糖链的功能更深入的研究常受到天然蛋白N-糖基化不均一的限制。此外,特定N-糖基化修饰对一些糖蛋白药物的重要影响也逐渐被揭示。免疫球蛋白G(immunoglobulinG，IgG)药物,作为临床上最广泛应用的糖蛋白药物,其Fc片段N-糖链的核心岩藻糖基化可以几十倍地影响IgG与受体的结合,而其末端唾液酸化水平对IgG的抗炎症活性则有着决定性的影响。对糖蛋白药物N-糖基化功能的更深入研究及特定糖型的糖蛋白药物在临床上的应用都需要高效获得均一化N-糖蛋白的方法。对此研究者们通过化学方法和细胞糖基化改造法进行尝试并取得了许多的进展,但由于化学合成剧烈的反应条件以及细胞内N-糖基化系统的复杂,合成带有特定N-糖链结构的均一化N-糖蛋白对研究者们仍是一个挑战。内切-β-N-乙酰葡萄糖苷酶(ENGase，EC3.2.1.96)是一种内切糖苷酶,可以专一性的水解N-糖链核心的双GlcNAc的β1,4糖苷键,常被用于N-糖蛋白的去糖基化研究。当以带有一个GlcNAc基团的N-糖肽/糖蛋白为受体时,一些ENGases也表现出了转糖基活性,可以将特定寡糖链转移到受体上,重新合成双GlcNAc核心的β1,4糖苷键。这种方法为均一化N-糖蛋白的体外合成提供了新的途径。ENGases来源的糖苷合成酶的出现以及唑啉化寡糖供体的使用,极大的提高了 ENGases的转糖基效率。原玻璃蝇节杆菌(Arthrobactor protophormiae)来源的EndoA和冻土毛霉(Mucor hiemalis)来源的EndoM以及两酶的糖苷合成酶已经被成功的用于多种均一化N-糖肽/糖蛋白的合成。虽然如此,这一方法仍存在许多限制。在受体方面,EndoA、EndoM及其突变酶都不能利用带有α1,6-岩藻糖基团的GlcNAc为受体催化转糖基反应。由于核心岩藻糖基化为N-糖链的一种常见修饰,而IgG的FcN-糖链也以岩藻糖基化修饰为主要类型,这需要寻找新的具有更广泛底物特异性的ENGases工具酶。在供体方面,目前仍没有能高通量检测ENGases供体底物特异性的方法,使得对常用ENGases供体底物特异性所知局限于常见的N-糖链结构,这限制了 ENGases在合成N-糖肽/糖蛋白的更广泛的使用。针对这些问题,论文的第一部分在ENGases的分子改造、ENGases合成均一化IgG及ENGasses供体底物特异性的高通量检测方法三个方面开展了工作。肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)来源的EndoD能够水解带有核心岩藻糖基化的N-糖链,并且EndoD原始酶表现出低转糖基活性。为了将EndoD改造为糖苷合成酶,本论文首先根据已经发表的EndoA和EndoM的突变结果对EndoD(135-1047位氨基酸)的四个位点进行了定点突变,得到了五个突变酶(N322A、N322Q、E324Q、Y360F 和 H371W)。EndoD-N322A 和 EndoD-N322Q失去了 95%以上的水解活性,EndoD-E324Q丧失了全部的水解活性,EndoD-Y360F和EndoD-H371W则表现出了与原始酶类似的水解活性。以Man3GlcNAc 唑啉糖为供体,EndoD-N322A、EndoD-N322Q、EndoD-Y360F 和EndoD-H371W均表现出对α1,6-岩藻糖基化GlcNAc受体或非岩藻糖基化GlcNAc受体的转糖基能力,并且突变酶对非岩藻糖基化GlcNAc受体表现出更高的转糖基活性。其中EndoD-Y360F和EndoD-H371W的转糖基活性显著高于原始酶,但仍会持续的水解产物,说明两个突变酶为转糖苷酶;而EndoD-N322A和EndoD-N322Q能持续的催化转糖基反应,对产物仅表现出微弱的水解活性,表现为糖苷合成酶。尤其是EndoD-N322Q可以在1小时内将90%以上的非岩藻糖基化GlcNAc受体转化为产物,在4小时内将87%的岩藻糖基化GlcNAc受体转化为产物,说明EndoD-N322Q同时为对岩藻糖基化和非岩藻糖基化受体进行糖基化的高效糖苷合成酶。对EndoD-N322A和EndoD-N322Q的转糖基动力学参数测定发现两酶对Man3GlcNAc唑啉糖供体拥有相近的Km值,但EndoD-N322Q的kcat值高出N322A的47倍;并且EndoD-N322Q对两种GlcNAc受体的kcat/Km值都高出EndoD-N322A的25倍以上,这些结果综合说明EndoD-N322Q的转糖基效率远高于EndoD-N322A。此外,EndoD-N322Q对岩藻糖基化GlcNAc的Km值高于其对非岩藻糖基化GlcNAc的24倍,而EndoD-N322A对这两种受体拥有类似的Km值。将Asn替换为Gln或Ala对EndoD的受体亲和力的巨大影响暗示着EndoD对岩藻糖基化N-糖苷的活性由于其反应腔内更灵活的空间可以容纳α1,6-岩藻糖,而非蛋白与岩藻糖间特异的相互作用。进一步以IgG药物rituximab(Genentech Inc.)为模式蛋白检测了 EndoD-N322Q合成均一化N-糖蛋白的能力。以rituximab的去糖基化(Fucα1,6)GlcNAc-Fc片段为受体,EndoD-N322Q能以超过95%的转化率将Man3GlcNAc转移到该受体上,从而合成了带有岩藻糖基化核心五糖结构的rituximab的Fc片段。这说明EndoD-N322Q可以有效的对IgG的Fc片段行糖基化改造,是首次报道的能合成带核心岩藻糖基化的均一化N-糖蛋白的糖苷合成酶。但由于EndoD的底物特异性限制,EndoD-N322Q不能利用复杂型寡糖为供体催化转糖基反应。酿脓链球菌(Streptococcus pyogens)来源的EndoS可以高效的水解IgG的Fc上复杂型N-糖链,EndoS的Asp-233为该酶预测的辅助唑啉环形成的残基,在该位点的定点突变得到了 D233A和D233Q两个糖苷合成酶。当以去糖基化的(Fucα1,6)GlcNAc-rituximab为受体时,EndoS-D233A和EndoS-D233Q能将唾液酸化复杂型糖链高效地(>95%)转移到rituximab上,从而首次合成了带有核心岩藻糖基化复杂型N-糖链的均一化IgG。此外,EndoS-D233A能将带有叠氮基团的N3Man3GlcNAc糖高效的转移到(Fucα1,6)GlcNAc-rituximab上。叠氮基团的引入为IgG糖链的标记、定向或进一步的糖基化改造提供了可能。EndoD-N322Q、EndoS-D233A和EndoS-D233Q的研究为带有核心岩藻糖基的均一化N-糖蛋白的合成及IgG的糖基化改造提供了有效的工具酶。为了寻找高通量研究ENGases转糖基供体特异性的方法,论文尝试了ENGases催化的成组转移寡糖的"block transfer"反应。以N-糖链结构已被清楚研究的鸡卵清白蛋白(chicken albumin)为模式蛋白,论文首先检测了 EndoA、EndoM、EndoD 和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)V583 来源的 EndoE2 对鸡卵清白蛋白的水解底物特异性,然后将这四种ENGases联合从鸡卵清白蛋白上水解下的混合糖链化学转化为唑啉化寡糖,并以此为供体检测了三种ENGases糖苷合成酶的转糖基能力。EndoA-N171A、EndoM-N175A以及EndoD-N322Q分别能将不同组成的寡糖转移到同一 GlcNAc受体上,并且表现出新的转糖基特性。EndoA-N171A能转移包括四天线复杂型糖链在内的多种寡糖,但对Man3GlcNAc 和 GlcNAcMan3GlcNAc 表现出转糖基偏好性。EndoM-N175A 对GlcNAcMan5GlcNAc和GlcNAc2Man5GlcNAc表现出显著高的转糖基活性,说明EndoM偏好转移杂合型糖链。EndoD-N322Q可以转移包括Man3-5GlcNAc在内的低分子量寡糖,但对GlcNAcMan3GlcNAc和GlcNAc2Man3GlcNAc表现出高转糖基活性,说明EndoD-N322Q对末端带有GlcNAc基团的低分子寡糖具有转糖基偏好性。这些结果为三个糖苷合成酶在N-糖蛋白合成上更广泛的应用提供了指导;同时也显示了”block transfer”反应用于检测ENGases供体底物谱的可行性。此外,EndoD-N322Q同时能通过"block transfer”反应将混合寡糖转移到GlcNAc-CD52糖肽受体上,说明该反应为N-糖肽的合成的一种潜在方法。论文的第二部分关注糖苷酶的水解活性及其在肠道微生物代谢碳源中的作用。岩藻糖基在包括黏蛋白、上皮细胞表面糖蛋白和人乳低聚糖(human milk oligosaccharides,HMOs)的人肠道糖缀合物的O-糖链或寡糖末端丰富存在,其中黏蛋白O-糖链在大肠部位以α1,3/4-岩藻糖基化为主,而HMOs中以α1,2岩藻糖基化为主。末端岩藻糖基的去除对肠道微生物利用这些糖缀合物起着关键的作用。α-L-岩藻糖苷酶(α-L-fucosidase)是在生物体中普遍存在的一类外切糖苷酶,分属于糖苷水解酶(glycoside hydrolase,GH)29和95家族。α-L-岩藻糖苷酶在肠道微生物代谢HMOs中的作用已有许多研究,但其在微生物利用黏蛋白O-糖链中的作用目前仍所知甚少。论文对产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)ATCC 13124的三个序列预测的α-L-岩藻糖苷酶(CpAfc1,CpAfc2和CpAfc3)进行了分子克隆、异源表达和酶学鉴定。CpAfc1拥有GH29家族的α-L-岩藻糖苷酶催化域,但对于研究底物没有表现出α-L-岩藻糖苷酶活性;CpAfc2被验证为GH 29-B亚家族的1,3-1,4-α-L-岩藻糖苷酶,CpAfc3被验证为GH95家族的1,2-α-L-岩藻糖苷酶。并且CpAfc2和CpAfc3都表现出对猪胃黏膜(porcine gastric mucin,PGM)上岩藻糖基的水解活性。为了研究三个酶在产气荚膜梭菌ATCC 13124利用黏蛋白O-糖链中的作用,论文将该菌在基础培养基(BM)、含0.5%PGM的基础培养基(BM-PGM)和含0.5%葡萄糖的基础培养基(BM-Glc)中进行培养,并测定了菌体生长、α-L-岩藻糖苷酶的基因转录和酶活水平。产气荚膜梭菌ATCC13124在BM-PGM中稳定期的菌体浓度相比BM高出25%;而该菌在BM-Glc中稳定期的菌体浓度的生长相比BM减少18%。在BM中afc1，afc2和afc3都有显著的转录量;在BM-PGM中afc2和afc3的转录水平高于BM中1倍和0.3倍,但PGM对afc1的转录影响不显著;而在BM-Glc中三个基因的转录都低于BM中4倍以上。这说明三个基因的转录可以被PGM诱导,而受到葡萄糖的强烈抑制。值得一提的是,afc2在三种培养基中的转录量为afc3转录量的3-6.8倍。对产气荚膜梭菌ATCC 13124产生α-L-岩藻糖苷酶活性的测定发现,BM-PGM中该菌的1,3-1,4-α-L-岩藻糖苷酶活性和1,2-α-L-岩藻糖苷酶活性分别为BM中相应活性的2.4倍和2.7倍,而在BM-Glc中两种酶的活性都降低12倍以上。并且在三种培养基中,该菌产生的1,3-1,4-α-L-岩藻糖苷酶活性都高于1,2-α-L-岩藻糖苷酶活性五倍以上。这些结果与基因的转录分析结果一致,说明CpAfc2和CpAfc3为产气荚膜梭菌ATCC 13124代谢黏蛋白O-糖链的重要α-L-岩藻糖苷酶,其中CpAfc2为该菌代谢的主要α-L-岩藻糖苷酶。产气荚膜梭菌ATCC 13124在培养条件下表现出对α1,3/4-岩藻糖基化寡糖显著快于对α1,2-岩藻糖基化寡糖的降解速度,说明该菌的高1,3-1,4-α-L-岩藻糖苷酶活性导致了其对α1,3/4-岩藻糖苷的代谢偏好性。由于人肠道的黏蛋白O-糖链从小肠到直肠具有逐渐升高的α1,3/4-岩藻糖基化比例,产气荚膜梭菌ATCC 13124的高1,3-1,4-α-L-岩藻糖苷酶活性将使该菌可以有效利用黏蛋白O-糖链,利于其在人肠道内的定殖。此外,由于HMOs中50-92%寡糖为α1,2-岩藻糖基化寡糖,产气荚膜梭菌ATCC 13124的低1,2-α-L-岩藻糖苷酶活性将不利于其利用HMOs为碳源,这一发现与之前报道的该菌在HMOs的弱生长一致，说明该菌对α13/4-岩藻糖苷的代谢偏好性为导致这种现象的重要因素之一。这些研究工作首次揭示了 α-L-岩藻糖苷酶对肠道致病菌利用黏蛋白O-糖链及在肠道定殖中的重要作用,丰富了人们对肠道微生物的代谢与生存之间关系的认识。综上,本论文对链球菌来源的两个ENGases(EndoD和EndoS)进行了分子改造,得到了 EndoD-N322Q、EndoS-D233A和EndoS-D233Q三个高效的糖苷合成酶,为带有核心岩藻糖基均一化N-糖蛋白的合成及IgG的糖基化改造提供了有效的工具酶。通过成组转移寡糖的“block-transfer”反应研究了 EndoA-N171A、EndoM-N175A以及EndoD-N322Q的转糖基供体特异性,发现了这三个ENGases来源糖苷合成酶新的转糖基特性,为高通量研究ENGases供体底物谱开发了有效的方法。本论文同时对产气荚膜梭菌ATCC 13124的三个α-L-岩藻糖苷酶进行了分子克隆、异源表达、酶学性质鉴定,并研究了该菌在不同碳源中的生长情况及α-L-岩藻糖苷酶的产生情况,揭示了 1,3-1,4-α-L-岩藻糖苷酶在该菌代谢黏蛋白O-糖链和肠道定殖中的重要作用,加深了人们对肠道微生物代谢与生存之间关系的理解,为该致病菌的防治提供了指导。