论文部分内容阅读
目的：白细胞介素15(Interleukin-15，IL-15)是1994年由Grabstrin等在检测猴肾表皮细胞系(CV-1／EBNA)上清液中的细胞因子时发现并克隆出来，其mRNA在胎盘、骨骼肌、肾脏和活化的单核巨噬细胞中可检测到，它与白细胞介素2(IL-2)没有序列同源性，但可与IL-2受体(IL-2R)的β和γ链相互作用，表现出许多与IL-2相似的生物学活性：体外诱导植物血凝素(PHA)刺激的正常外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤细胞(NK)和B细胞的增殖，以及细胞毒T细胞(CTL)和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的生成，并且IL-15还可以自分泌方式调节单核巨噬细胞分泌细胞因子，活化中性粒细胞，并延迟中性粒细胞的凋亡。IL-15还是T细胞趋化因子，因此在初始免疫反应阶段比IL-2更重要，可以促进免疫应答由初始免疫反应向适应性免疫反应过渡，增强免疫应答的强度。 柯萨奇病毒B3型(Coxsackievirus B3,CVB3)是引起人类病毒性心肌炎、无菌性脑膜炎和新生儿全身性感染等疾病的主要病原体。CVB3的VP1蛋白抗原性较强，可刺激机体产生具有保护作用的中和抗体。本研究的目的为，构建CVB3-VP1／IL-15基因的真核表达重组质粒，并观察其免疫效果，为研制防治病毒性心肌炎的核酸疫苗奠定基础。 中文摘要 方洁：从人胚肺H倍体细胞＊）中提取ILl 的InltrvA，用自行设计的人 ILq 5特异性引物进行 RTPCR扩增，将扩增产物与 pGEM＊ easy载体连接，转化 DH5a大肠杆菌，于含氨辛青霉素的ZYT培养基上筛选重组子，提取质粒进行酶切鉴定和测序。取双酶切的目的基因片断，与经过同样两种酶切的pCDNA3载体连接，经过转化、筛选和酶切鉴定后，构建成真核表达重组质粒pCDNA3JLd。用自订设计的引物从 pCDNA3－VP质粒上扩增出带有启动子的 VP基因，插入到 PCDNA3JLl质粒上，构建成真核重组质粒 PCDNA3VP ／IL八，转化DH5a大肠杆菌，经大量扩增纯化后，肌肉注射免疫Balb儿小鼠，每只100fig／次，共注射3次。每次免疫后的第六大，断尾取血检测CVB3 中和抗体。3 次免疫后用致死量（800TCID50）的CVB3感染小鼠，观察pCDNA3－VPI／IL八对小鼠的免疫保护作用。 结果：构建的 pCDNA3－VP ／ILl 5重组质粒目的基因与 CVB3．VP 禾 ILl 5 的标准序列 相 同；pCDNA3NP ／IL刁 5重组质粒免疫小鼠后，能诱导机体产生中和抗体，各次免疫后抗体滴度分别为＜：5、1：8尸和140。用800TCID50 CVB3感染小鼠，pCDNA3－VPI／IL－15重组质粒免疫组、pCDNA3－ILq＋PCDNA3N、pCDNA3JLJ、pCDNA3－VP重组质粒对照组、pCDNA3质粒对照组及生理盐水对照组，ZI大生存率分别为 35％、30O、100、25o、15o、10O，经X’检验，6组小鼠生存率无明显差异T列．05入 结论：本研究成功地构建了人白细胞介素15基因重 2 中文摘要 组真核表达质粒 pCDNA3－ILl；首次构建了柯萨奇病毒 VPI 基因和人白细胞介素15 基因双表达质粒 pCDNA3－VPI ／IL。15；用 pCDNA3－VPI ／IL－15、pCDNA3－IL－ 15＋p。DNA3－VPI、pCDNA3－VPI、重组质粒肌肉注射免疫 雄性46周龄BALB儿小鼠，三周后检测到了低水平的中 和抗体，抗体滴度随免疫次数增加而提高；用致死量的 CVB3（800TCID50）攻击pCDNA3－VPI／IL－15免疫三周的 雄性46周龄BALB儿 ／J’鼠，诱导机体产生的抗体不能保 护小鼠抵御CVB3的攻击。推测延长免疫时间，可增强本 基因疫苗的免疫应答。