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苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)自上世纪初被发现以来,已成为微生物农药中的重要一员,为有害生物的综合防治作出了重要贡献。从1938年第一个Bt制剂问世以来,有文献报道,其在微生物农药中所占份额达90%以上。苏云金芽孢杆菌可以产生多种毒素对昆虫、线虫和哺乳动物有毒害作用,而且可以对人类的某些疾病治疗有帮助。本研究对实验室前期从新疆马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)上分离获得的4个具有几丁质酶活性的Bt菌株进行了杀虫功能基因和蛋白研究。利用PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)和特异性PCR方法,对4个Bt菌株所含有的杀虫基因进行鉴定,分析它们的功能蛋白,并测定它们对柑桔小实蝇等害虫的控制作用。1杀虫基因的鉴定分析根据杀虫基因cryl-10的保守区域设计通用引物,再按照引物上加入的酶切位点碱基序列选择相应的限制性内切酶,对扩增产物进行双酶切,从限制性片段多态性图谱(RFLP图谱)分析其基因类型。结果表明,菌株CPB008和CPB012均含有cry1和cty2基因。将K5un3/K3un3引物扩增到的cry1基因,用Pst Ⅰ和Xba Ⅰ进行双酶切,得到1117 bp,801 bp,518 bp和322bp的序列。将S5un2/S3un2扩增得到的cry2基因用Hinc Ⅱ和Msp Ⅰ进行酶切,得到958 bp,791 bp,297 bp和273 bp等特异性条带。CPB016和CPB111两个菌株未检测到cryl-10基因。再通过设计二级分类基因特异性引物cry1A、cry1B等,鉴定菌株所含具体基因型。结果表明,CPB008含有cry1Aa、cry 1 Ac (GenBank登录号KR049190)、cry1Ia、cry2Aa (KR049192)和cry2Ab (KR049193); CPB012含有cry1Aa (KR049191)、cry1Ac、cry1Ia (KJ941157) cry2Aa (KR049194)和cry2Ab (KR049195)杀虫功能基因。其中对具有双元活性的cry 1Ia基因设计全长序列引物,扩增获得2159 bp(CPB012)全长基因(KJ941157),其结构完整。在对cry11-cry40、vip1-3、cyt1-2基因的检测中发现,CPB008和CPB016还含有vip3A基因,GenBank登录号分别是：KR049196和KR049197。而CPB016和CPB111未检测到相关基因。cry11-40, cyt1-2以及vip1-3基因检测参照普通PCR方法,结果显示4个菌株除CPB008和CPB012含有vip3A基因外,其它基因均无特异性条带。2晶体蛋白的形态观察与SDS-PAGE连续培养观察不同时间菌体和晶体蛋白形态显示,CPB008能够产生菱形、不规则形和球形晶体。CPB012能够产生方形、不规则形和球形晶体,而CPB016和CPB111能够产生球形晶体。蛋白晶体分离后进行SDS-PAGE分析,结果表明,CPB008能够产生135-140 kDa、80 kDa、70 kDa的特异性蛋白条带,CPB012能够产生135-140 kDa、80kDa和70kDa特异性条带,而CPB016和CPBl1l未见上述蛋白条带,与基因型测定结果吻合。3对柑桔小实蝇(Bactrocera dorsalis)杀虫效果测定四个菌株对双翅目害虫柑桔小实蝇(Bactrocera dorsalis)2龄幼虫的生测实验表明,被感染试虫与正常试虫相比,逐渐停止摄食,虫体中部先发黑,最后虫体全身发黑腐烂。CPB008和CPB012菌株接种后7d的累计死亡率LR7d分别为70.86%和76.72%,而CPB016和CPB111组未见幼虫死亡,虫体顺利化蛹。CPB008的LTso为3.1d,CPB012的LTso为2.4 d。CPB008的致死中浓度LCso为9.96×107 cells/mL, CPB012的致死中浓度LCso为2.03×l07 cells/mL。由此判断CPB012在4个菌株中,对双翅目柑桔小实蝇生物毒性最高。结合本实验前期用4个菌株对鳞翅目家蚕(Bombyx mori)和鞘翅目马铃薯甲虫的生物测定试验,最终判断它们均具有几丁质酶活性,当试虫是家蚕和马铃薯甲虫时,CPB008效果最好,当试虫是柑桔小实蝇时,CPB012效果最好。这也与CPB008和CPB012具有的多个cry1类和cry2类杀虫功能基因相符合。而CPB016和CPB111对家蚕和马铃薯甲虫具有一定的毒性,但是对于柑桔小实蝇不具有明显毒杀作用,可能是两菌株不能产生对双翅目专一性的杀虫蛋白所致。综上所述,来自于马铃薯甲虫的苏云金芽孢杆菌CBP008和CPB012菌株含有cry1类和cry2和vip3A类杀虫功能基因,可能调控合成了135-140 kDa、80 kDa和70 kDa的相应杀虫功能蛋白,因此对双翅目柑桔小实蝇、鞘翅目马铃薯甲虫及鳞翅目家蚕都具有很强的毒杀作用,在作物害虫的生物防治中将具有重要的开发应用价值。